Keap1―Nrf2―ARE信号通路与aGVHD的关系

【摘要】 造血干细胞移植（HSCT）是治疗血液系统恶性疾病重要的手段之一，但是移植后移植物抗宿主病（GVHD）的发生，严重影响HSCT患者的预后及生活质量。目前研究aGVHD机制发现氧化应激、炎症反应及Th1/Th2平衡均参与其中；而keap1-nrf2-ARE信号通路是抗氧化应激、减轻炎症反应及调节Th1/Th2分化平衡的主要通路，本文就该信号通路与agvhd的关系做一综述。

【关键词】 移植物抗宿主病； 信号通路

中图分类号 R730.2 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2014）11-0159-03

造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）目前已广泛应用于血液系统疾病、先天性代谢性疾病和免疫缺陷性疾病等治疗[1]，但是异基因造血干细胞移植后部分患者出现急性移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）。Jagasia等[2]对1999-2005年国际骨髓移植研究中心5561例恶性血液病患者异基因移植后aGVHD的发生率、总生存率及移植相关死亡率进行研究，发现在同胞和无关供者异基因造血干细胞移植中B-D级aGVHD发生率分别为39%和59%、5年移植相关死亡率分别为31%和40%、总体生存率分别为46%和33%，该研究显示异基因移植后aGVHD具有较高的发生率及死亡率。

aGVHD的发病机制包括以下三个阶段。（1）预处理方案导致的组织损伤：APC（抗原提呈细胞）活化及LPS（脂多醣）进入循环，刺激供者T细胞分泌大量细胞因子如TNF-α和IL-1，损伤组织；（2）异种T细胞活化与扩增阶段：APC活化后，形成HLA-肽复合物将抗原提呈给T细胞，促进效应T细胞的增殖和进一步分化，产生更多的炎性细胞因子，形成细胞因子风暴，主要包括TNF-α、IL-1和IL-6，作用于效应细胞，攻击受者靶器官；（3）细胞毒性T细胞直接的、炎症因子间接的对靶器官的损伤[3]。

目前对aGVHD的研究主要集中在T细胞和B细胞等特异性免疫领域，在过去几十年中，造血干细胞移植已经取得实质性进展，对免疫细胞或具有免疫调节作用的细胞、细胞因子在调控移植物抗宿主病和移植物抗白血病效应关系的作用方面有许多动物实验和临床早期的研究，取得了一定的认识[4]。免疫抑制剂是治疗移植物抗宿主病的主要药物，但其容易造成患者严重的感染，并且不能根本上延缓GVHD的进展。临床上移植患者使用免疫抑制剂治疗后完全缓解率低，不缓解的患者死亡率高，死亡原因为aGVHD本身或者免疫抑制所致的严重感染等并发症[3，5]。Keap1-Nrf2-ARE信号通路在抗肿瘤、抗凋亡、抗炎症反应、抗应激等方面发挥着广泛细胞保护作用，在心脏移植[6]、肝脏移植[7]等器官移植后有保护作用，本文就该信号通路与造血干细胞移植后aGVHD的关系作一综述。

1 Keap1-Nrf2-ARE信号通路的结构及活化机制

Keap1-Nrf2-ARE信号通路是抵抗氧化应激及外来化学物质损害的主要保护通路，其核心分子包括Nrf2、ARE和Keap1；该信号通路最常见的激活剂为叔丁基对苯二酚和莱菔硫烷；细胞核转录因子（Nrf2）是关键因子，它是一个基本的亮氨酸拉链转录因子，在人类由NFE2L2基因编码[8]；Nrf-2含有的6个高度保守的结构域：被命名为Nehl-Neh6；Neh1具有亮氨酸拉链结构，是Nrf2和Maf形成异二聚体并与抗氧化反应元件（ARE）结合的区域；Neh2含有ETGE和DLG两个模块，Keapl上有Kelch域，可与这两个模块结合；负性调节Nrf-2；Neh3可参与Nrf-2转录激活，该过程由CHD6辅助因子所介导；Neh4和Neh5两个区域一起与CREB（cAMP response element binding protein）蛋白相互作用，起到转录活化的作用[9]。在正常情况下，Nrf2与Keap1偶连并与胞浆肌动蛋白结合被锚定在胞浆，且被泛素蛋白酶体途径迅速降解，当受到来源于活性氧或亲核剂的信号攻击后，Nrf2从Keap1中解离，然后稳定状态的Nrf2转位进入细胞核，与Maf蛋白结合成异二聚体后与ARE结合，启动第Ⅱ相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因的转录其中Ⅱ相酶包括：谷胱甘肽S-转移酶（GST）、NAD（P）H：醌氧化还原酶1（NQO1）、UDP-葡萄糖醛酸转移（UGT）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物岐化酶（SOD）、血红素氧化酶-1（HO-1）等；Nrf2与Keap1解偶联是Nrf2信号通路激活的关键，主要通过以下两种途径：一是活性氧或亲电性化合物的直接攻击；其二是磷酸化的间接作用[10-11]。

2 Keap1-Nrf2-ARE信号通路参与aGVHD保护机制

2.1 参与抗氧化应激

氧化应激是体内活性氧化物产生多于清除的氧化还原反应失衡的病理状态。机体在遭受有害刺激时，活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）产生过多，超过抗氧化系统的防御能力，就会造成组织细胞的损害。机体存在两类抗氧化系统，一类是酶抗氧化系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等；另一类是非酶抗氧化系统，包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽等。Ferrara等[12]认为很多有害的自由基导致严重的细胞损伤，在aGVHD的发生过程中扮演重要的角色。自由基能加重aGVHD的组织损伤，不利于组织修复，换言之，抗氧化应激将有利于移植物抗宿主病后组织的修复，同时可以减轻组织的损伤。Qian等[13]研究发现氧化应激与GVHD关系密切，建议利用氢气可以选择性的减少羟基和过氧亚硝基等自由基的生成的原理，从而减轻氧化应激反应，提出了氢气可以治疗急性GVHD的假说。Keap1-Nrf2是抵抗氧化应激损害的主要保护通路；氧化应激作用下，Nrf2与Keap1解偶连从胞浆转移入胞核，与抗氧化反应元件ARE结合，启动ARE调控的谷光甘肽S转移酶（GSTs），过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、血红素氧合酶（HO1）Ⅱ相解毒酶表达，增加细胞对氧化应激的抗性，激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路，上调Ⅱ相酶的表达，可以减轻aGVHD。

2.2 减轻炎症反应

在aGVHD发病机制中，T细胞增殖分化，炎症因子的产生，如IL-1，IL-2，IL-12，IL-18，TNF和IFN-γ是GVHD发生的特点[14]。Ferrara等[15]研究发现巨噬细胞活化后产生的炎症因子NO阻碍肠上皮细胞和皮肤表皮细胞的修复参与GVHD的组织损伤。IL-1、TNFα是引起GVHD发生发展至关重要的细胞因子，这些细胞因子的血浆含量高低常常与GVHD的严重程度呈正相关。TNFα是促炎症因子中关键的可溶因子， 可以引起恶液质，诱导凋亡、坏死[16]。Levine[17]通过研究438例造血干细胞移植患者移植前及移植后7 d血浆TNFR1（TNFR1已经作为直接检测TNF-α的替代指标，TNFR1（存在于多种细胞膜表面，TNF-α与受体结合后形成受体-配体复合物，释放到血浆中，能用酶联免疫法检测到）水平发现，随着患者发生GVHD反应的程度加重，TNFR1水平逐渐升高，进一步通过多因素分析认为TNFR1水平是GVHD病变程度的独立预测因子。Keap1-Nrf2-ARE信号通路与减轻炎症相关的发病机制有关，如自身免疫性疾病、风湿性关节炎、哮喘、肺气肿、胃炎、结肠炎和动脉粥样硬化。Kim等[18]认为激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路会抑制炎性细胞因子、炎症趋化因子、细胞黏附分子、金属蛋白酶、环氧合酶2（COX-2）等促炎症介质的释放。Otterbein等[19]研究发现角叉菜胶（carrageenan）激活Nrf2信号通路可以使得细胞内HO-1（血红素加氧酶）和氧化物还原酶1（Prx1）的表达上调，HO-1可以通过产生低浓度一氧化碳来中和LPS诱导的促炎因子TNFα和IL-1，而Prx1是抑制MIF（ 巨噬细胞游走因子）的抗炎症因子。这些研究结果均显示，通过诱导剂诱导Keap1-Nrf2-ARE信号通路的激活可以抑制促炎因子TNFα和IL-1，从而达到预防及治疗GVHD的目的。

2.3 调节Th1/Th2平衡

Th1/Th2之间的平衡决定器官的损伤程度[20]。由Th1细胞分泌的IL-2、TNF-α是启动GVHD主要的细胞因子，增强杀伤细胞的细胞毒性作用，导致腹泻、体重下降、皮肤改变等多系统损害；以表达IL-4、IL-6、IL-10为主的Th2型细胞，起着控制炎症反应，从而减轻GVHD的组织损伤[21]。Tawara等[22]实验研究证实当供体T细胞分泌IL-4、IL-5、IL-9和IL-13（四个经典Th2细胞分泌的细胞因子）能力下降时，增加了移植物抗宿主病发生率。Rockwell等[23]研究发现：Nrf2基因缺失的小鼠体内，IL-4、IL-5、IL-13水平明显下降，IFN-γ水平升高，在给小鼠喂养tBHQ（一种食物添加剂，能激活Nrf2基因）后，Nrf2信号通路相关基因的表达明显升高，IFN-γ水平受到抑制，IL-4、IL-5、IL-13水平升高，促使小鼠体内CD4+T细胞向Th2细胞分化，抑制Th1细胞的分化。因此，激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路，可以促使小鼠体内CD4+T细胞向Th2细胞分化，抑制Th1细胞的分化，对aGVHD的损伤起保护作用。

Keap1-Nrf2-ARE信号通路可能从抗氧化应激、减轻炎症反应以及调节T细胞分化参与保护aGVHD反应所致的细胞、组织损伤，对该信号通路实施干预，有可能从分子水平防治HSCT患者术后发生aGVHD反应。

3 展望

移植物抗宿主病的发生依然是异基因造血干细胞移植乃至器官移植发展的主要障碍，目前对其防治主要采用免疫抑制，移植物抗宿主病严重影响患者预后、长期生存时间及生活质量；而Keap1-Nrf2-ARE信号通路通过参与抗氧化应激反应、减轻炎症反应以及影响T细胞分化、调节Th1/Th2平衡，从而保护GVHD影响的靶细胞、减少组织损伤，通过对该信号通路与GVHD损伤的进一步研究，有可能为GVHD的防治提供新的防治靶点，为异基因造血干细胞移植患者预后带来新的希望。

参考文献

[1] Gratwohl A，Passweg J，Baldomero H，et al. Blood and marrow transplantation activity in Europe 1997. European Group for Blood and Marrow Transplantation （EBMT）[J]. Bone Marrow Transplant，1999，24（3）：231-245.

[2] Jagasia M，Arora M，Flowers M E，et al. Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation[J].Blood，2012，119（1）：296-307.

[3] Ferrara J L，Levine J E，Reddy P，et al.Graft-versus-host disease[J]. Lancet，2009，373（9674）：1550-1561.

[4] Alpdogan O.Advances in immune regulation in transplantation[J]. Discov Med，2013，15（82）：150-159.

[5] Qian L，Shen J. Hydrogen therapy may be an effective and specific novel treatment for acute graft-versus-host disease （GVHD）[J].J Cell Mol Med，2013，17（8）：1059-1063.