麝香保心丸促进斑马鱼血管生成作用

【摘要】 目的 探讨麝香保心丸对斑马鱼血管的新生作用。方法 以重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为阳性对照，以生理盐水为阴性对照，作用于斑马鱼(zebrafish),通过长度和血管面积计数，评估麝香保心丸对斑马鱼血管新生的促进作用和剂量依赖性。结果 麝香保心丸50 g/L组整体血管长度(113270 μm)和血管面积(1608950 像素)分别与阳性对照组血管长度(86902 μm)和血管面积(121645像素)相比较有明显的差异性(**P

【关键词】 麝香保心丸;斑马鱼;血管新生;模式生物

作者单位：510000 广州医学院第一附属医院 斑马鱼(Danio reio, 旧称Brachydanio reirio)，俗称“zebra fish”或者“zebrafish”，属硬骨鱼类，辐鳍纲(Actinopterygii)，鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae) 短担尼鱼属(Danio)。原产印度，是一种性情温和、杂食性的淡水鱼［1］。斑马鱼约有10余个品系，目前研究中常用的有源于德国的Tübingen和源于美国的AB两个品系。斑马鱼体呈梭型，个体长约5 cm左右，喂养简单，经济成本低，容易大规模饲养。斑马鱼生长周期短，3个月就可以性成熟。雌鱼每周个产卵一次，每次几百枚不等。斑马鱼的胚胎发育在体外完成，并且透明可见，胚胎时期血管走向清晰，结构简单，这使得研究者能从完整的活体观察到心血管系统发育情况和血液循环，甚至可以观察到基因的转录和蛋白表达情况，避免了杀死或解剖动物，非常适合用于血管发生的研究。

血管新生是促进肿瘤生长和进展的因素之一，同时也是治疗缺血性疾病的关键。然而影响血管新生的因素有很多，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及其受体家族(VEGF receptor)、血管生成素及其受体Tic 家族和重组碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast grouth factor, bFGF)对血管的新生和发育起着相当重要的作用。然而，现在对促血管生成的中药研究和应用还比较少。麝香保心丸是中药治疗冠心病的代表药之一，临床实践和药理研究证明麝香保心丸有显著的抗心肌缺血作用［2］，但对其在缺血心脏冠脉侧枝血管生成方面的作用机制尚未清楚，本实验通过观察麝香保心丸对斑马鱼模型血管新生影响，探讨麝香保心丸促血管生成的效应，为进一步研究其在改善缺血心脏侧枝循环方面的作用提供依据。

1 材料与方法

11 斑马鱼胚胎的准备 实验斑马鱼为AB系普通斑马鱼和血管荧光转基因斑马鱼(Flk1)，取自美国哈佛大学医学院。根据Westerfield［3］的方法进行养殖和繁殖，雌雄分开喂养于(285±1)℃的环境中，使用自动计时器保持14 h光照/10 h黑暗交替循环，每日分三次定时喂以丰年虾(brine shrimp)。养鱼系统中使用日夜循环水，每天补充10%新鲜去离子水。

参照斑马鱼手册［4］阐述的方法，将健康成熟的斑马鱼按雌雄1/2的比例放入鱼缸中，次日搜集雄鱼雌鱼产下的受精胚胎。每次试验设置4～5对斑马鱼，平均每对鱼能够产下100~150个受精胚胎，斑马鱼胚胎培养在胚胎水中(02 g/L 的即溶海盐水溶液)，放于285℃的孵箱中培养。培养大约20 h(21个体节阶段)后挑出健康的胚胎，用1 mg/ml 的蛋白酶(Sigma,p5459)水解去卵膜，再放入胚胎水中浸泡洗涤5 min。将胚胎随机分组后培养到96孔板中，每组设6个副孔，每孔放3个，每孔加入200 μL胚胎水。因为斑马鱼胚胎可以从卵黄球里汲取营养，所以在整个实验过程都不要给予营养补充。

12 药物的配制和加入 取1 g 麝香保心丸(购于上海和黄药业有限公司)溶于20 ml蒸馏水中(50 g/L)，37℃搅拌成混悬液，再分别胚胎水稀释成25 g/L，125 g/L，和625 g/L，离心后取上清，用022 μm的滤头过滤灭菌。bFGF购于武汉人禾医药有限公司，用022 μm微孔滤膜过滤载体，高温蒸汽灭菌后待用。 选择受精20 h(hours post fertilization, h pf)的斑马鱼胚胎，将不同浓度的麝香保心丸按组别加入到斑马鱼的培养基中，每孔20 μL，阳性对照组每孔加入50 μL bFGF，阴性对照组每孔加入20 μL 09%的生理盐水。然后将斑马鱼胚胎置于285℃的孵箱中继续培养48 h.

13 结果观察和处理 斑马鱼胚胎发育到72 h pf 时，吸出培养基，加入200 μL 4%的多聚甲醛PBS(pH=74)溶液，室温静置10 min后将斑马鱼置于凹槽载玻片里，在体系显微镜(Nikon AZ100)下观察拍照。为了使斑马鱼侧躺在载玻片里，方便观察肠下血管网络，尽量吸干载玻片上的固定液。因为斑马鱼的卵黄球是一个充满液体的圆形结构，不同局部对光的反射程度不一样，所以在观察过程在卵黄球里的血管网会出现部分不清晰的情况，为了能够全面地观察和拍摄到肠清晰的下血管网络，可以从斑马鱼与载玻片接触的这一面进行观察和拍照，由于卵黄球受到载玻片的挤压，呈扁平状，有利于观察拍照。

选择20×20倍数对斑马鱼肠下血管进行拍照，使用NIH Image 图像处理软件 (由美国国家卫生研究院(US National Institutes of Health)研发，rsbinfonih gov/nihimage/)对血管长度进行定量计算；使用Imageproplus 60 对血管面积进行定量分析。通过使用这两款软件的点对点计算方法，可以实现血管总长度计算、血管网的延伸长度计算以及血管面积计算［5］。

2 结果

麝香保心丸组对鸡胚血管生成有明显促进作用。如图 1所示，在显微镜下可观察到实验组(图 1B, D)比空白对照组(图 1C)和阳性对照组(图 1A)的血管明显增多，分支增多，血管面积和直径增大。实验组和阳性对照组均可见钉凸样血管新生现象(图 1A, B的箭头处)空白组的血管保持正常生长，整体分布均匀。阳性对照组的血管面积较实验组大，但比阴性对照组要小。对血管面积和血管整体长度进行计算后作图实验组与阴性对照组比较差异有统计学意义(**WTBX〗P