止颤汤对神经干细胞移植后帕金森病大鼠尿液中DA及其代谢产物含量的影响

摘要：目的 观察止颤汤对神经干细胞（NSC）移植后帕金森病（PD）大鼠尿液中多巴胺（DA）及其代谢产物含量的影响，探讨其对NSC移植后存活及定向分化的作用。方法 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）脑内定向注射建立PD大鼠模型，经NSC移植后予止颤汤灌胃。应用高效液相色谱法（HPLC）测定PD大鼠尿液中DA及其代谢产物高香草酸（HVA）、双羟苯乙酸（DOPAC）的含量。结果 止颤汤可以提高NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代谢产物的含量并改善其行为学。结论 止颤汤可能促进PD大鼠脑内NSC移植后的存活，并且分化为多巴胺能神经元发挥功能，同时抑制DA排泄，从而达到治疗作用。

关键词：帕金森病；止颤汤；干细胞移植；DA代谢；大鼠

中图分类号：R742.5 R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）08-0975-02

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是由于多种原因导致脑内黑质多巴胺（Dopamine，DA）能神经元退行性病变从而DA分泌减少引起的。干细胞移植是PD的理想治疗方法［1］，通过干细胞中最适合于中枢神经系统细胞替代治疗的神经干细胞（neural stem cell，NSC）移植以期重建PD患者DA能神经元的功能。因此如何促使移植入脑内的NSC存活且定向分化为DA能神经元，并发挥功能成为亟得解决的问题。本实验观察了中药复方止颤汤对NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代谢产物含量的影响，以期为解决NSC移植治疗PD中的疑难问题提供中医药实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠48只，均为雄性，体重260 g±20 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，动物编号：SCXK（沪）2007-0005。

1.2 药品与试剂 止颤汤主要由黄芪、丹参、白芍、升麻、知母、钩藤等8味中药组成。诸药均经鉴定符合药典规定的质量标准。高效液相所用的标准品DA、DOPAC、HVA：美国Sigma公司。

1.3 主要仪器 鼠脑立体定位仪：上海江湾Ⅱ型，液相色谱仪：HPLC Agilent 1200，Agilent Zorbax oligo 80 mm×6.2 mm,5 μm column。

1.4 方法

1.4.1 模型制备 采用大鼠脑立体定位MPTP注射法制模［2］。术后14 d，颈部皮下注射诱导剂阿扑吗啡（Apo）后，测量大鼠30 min内向损毁侧旋转总次数，若大鼠旋转圈数>210 r/30 min（>7 r/min），视为成功PD大鼠模型。

1.4.2 NSC的分离培养及鉴定 参照文献［3］，选取孕14 d的Wistar大鼠胚胎，分离出中脑组织，机械消化成单细胞悬液，种植于塑料培养瓶中，5%二氧化碳，37 ℃环境中培养，待原代克隆出现后（7 d～10 d），离心收集神经球，胰酶消化，吹打成单细胞悬液，1×105 /mL浓度种植于新培液中，每7 d换液传代1次，离心收集形成的神经球，经甩片到多聚赖氨酸包被的玻片上，固定后进行免疫细胞染色，检测NSC特异性蛋白Nestin的表达，鉴定所培养细胞中NSC细胞数量及传代后生长情况。

1.4.3 动物分组及给药 将48只大鼠随机分为4组。NSC移植组：大鼠PD模型制作后，将NSC注射入PD大鼠损毁侧黑质纹状体内，同时用生理盐水4 mL，每天分2次灌胃。正常组：正常大鼠，脑内同一位置注射等量培养基，同时用生理盐水4 mL，每天分2次灌胃。模型组：模型制作后，同正常组处理。止颤汤组：同样方法将NSC移植入PD大鼠模型，同时将止颤汤1.2 mL/100 g用生理盐水稀释为4 mL，每天分2次灌胃。

1.4.4 行为学测试 分别于处理后7 d、14 d、28 d颈部皮下注射阿扑吗啡，诱发其旋转行为，动物旋转时以患侧后肢为支点、身体环曲、首尾相接的原地旋转，伴觅食样动作，旋转360°为一转，30 min内记录大鼠的旋转圈数。

1.4.5 取材及材料处理 动物在处理后第28天末次灌胃后进行行为学测试，次日晨收集尿液置入-80 ℃超低温冰箱保存备用。测样时，室温下解冻，每次进样10 μL。高效液相色谱法检测DA、DOPAC及HVA含量［4］。

1.5 统计学处理 数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用t检验，采用统计软件中One-Way ANOVA进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 大鼠行为学测试结果（见表1）

表1 各组大鼠行为学测试结果比较（x±s）r/30 min

2.2 PD大鼠尿液中DA、DOPAC、HVA含量及DA/DOPAC、DA/HVA比值比较（见表2）

3 讨 论

止颤汤是本科室李如奎教授多年治疗PD的经验效方，主要有黄芪、当归、丹参等药组成，有益气养阴、清热祛瘀、熄风通络作用，在临床研究中取得较好疗效［5］，实验研究中有发现天麻、当归等中药可以诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞［6］，黄芪和丹参不仅有诱导间质干细胞定向分化为神经元样细胞的作用，且可能对脑内NSC的增殖及向多巴胺能神经元分化有促进的作用［7,8］。本实验结果显示，止颤汤组行为学转数随时间延长较模型组明显减少（P

但是，本实验不能排除中药对脑内损毁DA能神经元本身的修复和残存DA能神经元功能以及内源性NSC分化为DA能神经元的促进作用，对此尚需进一步研究。

参考文献:

［1］ 钱忠明,李琳,王玮,等.干细胞移植治疗帕金森病研究进展［J］.中国神经科学杂志,2002,18（3）:634-638.

［2］ Rubio-Osornio M,Montes S.Copper reduces striatal protein nitration and tyrosine hydroxylaseinactivation induced by MPP+ in rats［J］.Neurochemistry International,2009,54:447-451.

［3］ 李凌松,路艳艳.神经干细胞及帕金森病的细胞治疗［J］.北京大学学报,2002（3）:499.

［4］ 刘师莲.大鼠脑组织单胺类递质及其代谢产物的检测方法研究［J］.山东大学学报,2002,40（5）:472-475.

［5］ 刘毅，李如奎.止颤汤治疗帕金森病31例临床观察［J］.山西中医，2002，18（3）:16-17.

［6］ 刘金保,董晓先,董燕湘,等.多种中药成分诱导大鼠骨髓间质干细胞转变为神经元样细胞［J］.中国药物与临床,2003,3（3）:234-236.

［7］ 余勤,罗依,董勤,等.黄芪对间质干细胞分化为神经元样细胞的定向诱导作用［J］.中华急诊医学杂志,2004,13（12）:826-829.

［8］ 项鹏,夏文杰,王连荣,等.丹参注射液诱导间质干细胞分化为神经元样细胞［J］.中山医科大学学报,2001,22（5）:321-324.

作者简介：宋杰（1985―），男，现为上海中医药大学2009级中医内科学硕士研究生（邮编:200071）；施慧芬（通讯作者），工作于上海中医药大学附属上海市中医医院（邮编:200071）。

（收稿日期：2011-04-06）

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