重视母乳对婴儿的新成分

本文作者：余章斌 郭锡熔 单位：南京医科大学附属南京妇幼保健院儿科

对母乳成分的研究不断给人带来惊喜，母乳中大量的活性物质不断被人们发现:如对婴儿的视力和认知能力的发育有促进作用的多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)［1］，具有抗感染活性能提升机体的免疫力的乳铁蛋白(lacto-ferrin，LF)等［2］。婴儿配方乳以母乳为标准，尽可能地模仿母乳，在配方乳中添加DHA、LF等活性成分［3-4］，使其组分尽可能接近母乳，但母乳中含有的活性成分物质还远远没有被人们所解析，新的母乳成分不断被发现，如具有肠道保护作用的胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂(pancreaticsecretorytrypsininhibi-tor，PSTI)［5］，能杀死癌细胞的“哈姆雷特(humanα-lactalbuminmadelethaltotumorcells，HAMLET，为母乳中α-白蛋白和脂肪酸结合后形成的混合物)”［6］，这些新的母乳成分的发现及随之发展起来的母乳类似物的添加研究极大地推动了婴儿营养医学的内涵，同时也使人们更加认识到母乳是一个营养成分的宝库，继续发掘母乳中新的成分并对其功能研究显得十分必要。

1microRNA的发现及功能

1993年，Lee等［7］在秀丽新小杆线虫中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4;2000年，Reinhart等［8］又在该线虫中发现第二个异时性开关基因let-7。2001年10月研究者分别从线虫、果蝇和人体内找到几十个类似的微小RNA基因，将其命名为微小RNA(microRNA，miRNA)［9］。目前根据miRNARegistry公布的数据，仅仅在人体内就大约存在1658个miRNA(Release18:November2011)，大约覆盖了3%的人类基因组序列。miRNA大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制［10］。miRNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发生等［11］，可作为疾病的诊断标志物或干预治疗靶标［12］。

2母乳中miRNA的筛选检测及分析

miRNA不仅存在于实体组织中，也存在于体液中，研究者已经在人体的12种体液中均检测到miRNA［13］，如人的外周血清与血浆［14-15］、唾液［16］、尿液［17］，孕妇的羊水等［18］，这些miRNA是人体生理与病理状态时的真实反应，可以作为疾病的诊断标志物和治疗的干预靶标［19］。

2．1人miRNA芯片筛选母乳中miRNA及其功能分析Weber等［13］采用人miRNA检测芯片(HumanmiS-criptAssaypanel，德国Qiagen公司，可检测714个人miRNA)筛选检测人母乳中miRNA，结果检测到母乳中429个miRNA，其中miR-335*、miR-26a-2*、miR-181d、miR-509-5p、miR-524-5p、miR-137、miR-26a-1*、miR-595、miR-580及miR-130a含量最丰富，而miR-193b、miR-10a、miR-28-5p、miR-924、miR-150*、miR-518c*及miR-217是母乳有的miRNA，在其他11种体液中均没有发现，并且miR-518c*特异高表达于胎盘中［20］，对这些miRNA功能的深入研究将揭示它们在母乳中的作用。在对母乳miRNA功能的深入研究中，Kosaka等［21］采用miRNA芯片(HumanMicrornaMicroarraysVersion1．5，美国Agilent公司，可检测723个人miRNA)筛选人母乳中miRNA，结果检测到母乳中miRNA281个，发现11个miRNA与婴儿免疫器官发育和免疫功能的调节有关。其中miR-181a、miR-181b、miR-155、miR-17、miR-92a、miR-150与T和B细胞介导的细胞免疫应答有关;miR-125b、miR-146a、miR-146b与固有免疫反应有关;miR-223与粒细胞分化、非特异性免疫反应有关;Let-7i与胆管细胞免疫反应有关。通过对这些母乳中miRNA作用的靶基因来分析它们与婴儿免疫器官发育和免疫功能调节的关系，其中miR-181a通过调节T细胞受体(Tcellre-ceptor，TCR)的强度和阈值，进而影响T细胞对抗原的敏感性。过度表达miR-181a可使成熟T细胞对抗原敏感性增加，弱抗原就能有效诱导TCR信号;而沉默miR-181a则降低TCR信号的强度［22］;miR-181a还可调节淋巴细胞的多个磷酸酶，如胞质蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-2)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22(PTPN22)、双特异性磷酸酶5(DUSP5)，增强TCR信号分子Ick和erk的活性，从而影响T细胞和B细胞发育［22］。母乳中miR-181b、miR-155均可以作用于B细胞活化诱导激活的胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-in-ducedcytidinedeaminase，AID)，它是一种有效的DNA诱变物，是实现B细胞的抗体多样化的重要分子。B细胞在AID的诱导下开始进行体细胞阶段的高度突变，产生编码不同抗体的B细胞，进而完成抗体种类转换重组(class-switchrecombination，CSR)过程，最后在生发中心接受筛选，对病原体具有高亲和力且不会产生自身免疫的B细胞才能最终胜出。miR-181b、miR-155均可以抑制AID的活性从而阻止B细胞的恶性转化［23-24］。进一步的研究还表明miR-155能够抑制AID在活化B细胞中的表达，去除该抑制效应会导致B细胞形成缺陷［25］。miR-17、miR-92a是miR-17-92基因簇的2个因子，与细胞免疫也密切相关。Xiao等［26］构建淋巴细胞过表达miR-17-92的小鼠，小鼠出现了淋巴细胞过度增生，出现自体免疫性疾病后死亡;敲除miR-17-92基因簇的小鼠出现免疫功能损害而死亡［27］，进一步的研究发现基因PTEN、BIM是miR-17-92的靶基因，它们在T细胞的发育过程中起到重要作用。因而，研究者认为miR-17、miR-92a可能通过靶基因PTEN、BIM而发挥免疫效应。miR-150可以抑制B细胞的形成，其靶基因为c-Myb，miR-150可抑制c-Myb而影响B细胞活化，调控体液免疫应答［28-29］。通过生物信息学分析表明，TNF-α是miR-125b的靶基因，过表达miR-125b可降低TNF-α转录，下调TNF-α诱导的免疫细胞的活性［30］。炎性细胞因子肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNFreceptor-asso-ciatedfactor6，TRAF6)与白细胞介素1受体相关激酶1(IL-1receptor-associatedkinase1，IRAK1)为miR-146a与miR-146b的靶基因，是Toll样受体通路的下游基因。miR-146a与miR-146b可抑制TRAF6与IRAK1的表达，负反馈调控Toll样受体而参与炎症反应［31］。miR-223可调控脂多糖(lipopo-lysaccharide，LPS)，LPS诱导脾细胞产生干扰素-γ而发挥抗感染效应，敲除miR-223小鼠更容易发生肺损伤和多器官组织损伤［32］。Toll样受体4(Toll-likereceptors，TLR4)是Let-7i的靶基因，Let-7i能调控胆管细胞TLR4的表达，参与上皮细胞免疫反应，对短棒状杆菌有拮抗作用［33］。

2．2下一代测序技术筛选母乳中miRNA及其功能分析Zhou等［34］采用下一代测序技术(美国Illumina公司测序仪，测序比对1424个miRNA，miRBase17．0)筛选人母乳中miRNA，结果检测到母乳中miRNA602个，59个miRNA与婴儿免疫器官发育和免疫功能的调节有关，其中miRNA(miR-148a-3p、miR-30b-5p、let-7f-1-5p、miR-146b-5p、miR-29a-3p、let-7a-2-5p、miR-141-3p、miR-182-5p、miR-200a-3p、miR-378-3p)含量最丰富，占合计检测到的602个miRNA总量的62．3%。其中4个含量丰富的miRNA(miR-30b-5p、miR-146b-5p、miR-29a-3p、miR-182-5p)与婴儿免疫器官发育和免疫功能的调节有关。对这些miRNA的靶基因进行分析，发现miR-30b-5p的靶基因为氨基半乳糖转移酶(N-acetylgalactosaminyltransferases，Gal-NActransferases)，与细胞的侵袭与免疫抑制有关［35］。miR-146b-5p的靶基因为核转录因子κB(nucleartranscriptionfactorkappaB，NF-κB)，参与固有免疫反应［36］。miR-29a-3p的靶基因为干扰素-γ，能抑制细胞内病原体的免疫反应［37］。miR-182-5p可以诱导IL-2的生成参与T细胞介导的细胞免疫应答［38］。

3母乳中miRNA的研究展望

3．1母乳中与免疫器官发育和免疫功能调节相关miRNA的深入研究对于母乳中miRNA的筛选及其功能研究才刚刚起步，目前研究主要集中在母乳中miRNA与婴儿免疫器官发育和免疫功能调节的关系，由于新生儿的免疫系统尚不成熟，容易发生各种感染性疾病，而这些母乳中具有免疫保护作用的miRNA的发现，无疑将对研究感染性疾病的预防提供新的希望。近年的研究表明，miR-146a和miR-223可以作为败血症的诊断标志物，其中受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积分别为0．858和0．804［39］;而miR-150、miR-574-5p的水平和败血症的严重程度密切相关，可以作为败血症病人预后评价的标志物［40-41］。这些miRNA(miR-146a、miR-223、miR-150和miR-574-5p)在败血症病人体内明显降低，而母乳中这4种miRNA含量均较高，我们认为给患儿进行母乳喂养，可以增加婴儿体内这些miRNA的水平而起到抗感染的作用。它们在炎症感染时具有抗御病原体入侵的能力，如采用脂多糖刺激新生儿的脐血，发现miR-146a在24h内明显升高，通过负反馈调控Toll4而发挥抗炎作用［42］。但尚没有动物实验表明在炎症感染时添加这些miRNA可以起到抗感染的作用，这方面的临床应用前动物实验和机理研究急需开展。总之，这些母乳中具有抗感染作用的miRNA将为我们预防和治疗感染性疾病提供新的干预靶标，同时可以作为配方乳添加物质使其成分更接近母乳。

3．2母乳中miRNA的其他生物学功能目前除对母乳中与免疫器官发育和免疫功能调节相关的miRNA进行了初步研究外，母乳中发现的其他miRNA尚没有进行深入的生物学功能分析。现有研究分别采用芯片和下一代测序技术筛选均发现组织特异性的miRNA在母乳中含量较高［21，34］，如肌肉特异性的miR-1和miR-206;肝脏特异性的miR-122;胰腺特异性的miR-216和miR-217等，这些miRNA在心脏、肝脏和胰腺的发育中起到重要的作用，母乳中含有的这些miRNA是否与婴儿器官的发育和功能保护有关，目前尚未有实验数据评估，迫切需要开展相关研究进行证实。Zhou等［34］还发现脂肪组织特异的miR-642a在母乳中含量较高，而miR-642a在脂肪生成过程中起到重要作用［43］，母乳喂养的婴儿miR-642a摄入增加，是否对婴儿脂肪的生成、体重的增加有一定的促进作用，目前无实验研究评估，这些方面的深入研究将开辟从miRNA的角度研究儿童营养的新思路。总之，母乳中目前检测到的miRNA有602种，对它们在母乳中的作用与功能的深入研究非常必要。

3．3母乳中miRNA含量的影响因素母乳的成分随着泌乳期的变化而变化，母乳的成分也受到乳母膳食营养、饮食习惯、民族、文化和地域等因素的影响。目前没有研究对母乳中miRNA随着泌乳期的变化情况的数据发表，也没有研究表明母乳中miRNA受民族、文化和地域的影响情况。Kosaka等［21］研究表明母乳中miRNA存在个体差异，受到乳母膳食营养、饮食习惯的影响。食物中含有的miRNA能通过饮食摄入哺乳动物体内，如一种大米中大量存在miRNA(miR-168a)，用这种大米喂食小鼠后，研究人员在小鼠的血液、肺、小肠和肝脏中均发现miR-168a浓度显著上升，其中低密度脂蛋白受体连接蛋白1基因(low-densitylipoproteinre-ceptoradapterprotein1gene，LDLRAP1)为其靶基因，当miR-168a被人体胃肠道黏膜上皮细胞摄取，包装到微囊泡中，然后分泌到血液，进入肝脏结合到LDLRAP1上，抑制体内LDLRAP1蛋白表达，增加血液中的LDL和胆固醇水平，从而增加代谢综合征的风险，这为基于外源性miRNA加强或抑制表达来开发新的治疗疾病的策略提供可能［44］。同理，乳母可通过膳食的调整来弥补某些miRNA的缺陷，从而增加母乳定miRNA的含量来达到营养或免疫的作用。

3．4母乳与配方乳中miRNA的差异表达研究研究者对母乳与牛乳中miRNA的种类和含量进行比较，在对配方乳的来源:奶牛不同泌乳期的牛乳进行miRNA筛选发现，其中含有245种miRNA，与母乳中miRNA种类及含量相比，3种与婴儿免疫器官发育和免疫功能调节有关的miRNA(miR-146a，miR-142-5p，miR-155)含量比母乳低，3种与婴儿免疫器官发育和免疫功能调节有关的miRNA(miR-181a，miR-223，miR-150)含量与母乳相当，部分母乳中存在的与婴儿免疫器官发育和免疫功能调节有关的miRNA(miR-181b、miR-17、miR-92a、miR-125b、miR-146b)在牛乳中缺乏。此外，牛乳中肌肉特异性的miR-1、miR-206和肝脏特异性的miR-122较母乳含量低;胰腺特异性的miR-216和miR-217缺乏，而母乳中含量较高［21，45］。所以，母乳中存在的miRNA较配方乳更全面，其成分更接近婴儿生理需要。研究还发现奶牛不同泌乳期牛乳中的miRNA成分不同，初乳中与免疫和组织分化相关的miRNA(miR-18a，miR-19a，miR-140-5p，miR-219-5p)含量较高，成熟乳中与肌肉和感觉组织相关的miRNA(miR-10b，miR-9)含量较高［45］，这和人体生后不同时期对营养成分需求是一致的，因而，对不同时期母乳成分的研究，可以对婴儿阶段性营养的差异研究提供依据。总之，母乳中新成分miRNA的发现，给儿童营养相关研究带来新的机遇，对配方乳的生产研发和质量评价起到一定的推动作用，但母乳中miRNA的组分、含量及其生物学功能的相关研究才刚起步，值得儿科营养学者的重视。