电针对阿尔茨海默病模型大鼠海马胆碱能神经元的影响

[摘要] 目的 观察电针对阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）大鼠海马乙酰胆碱酯酶（AchE）和乙酰胆碱转移酶（CHAT）的影响。 方法 通过Morris水迷宫筛选48只健康Wistar大鼠随机分为4组。除正常组外，其余3组大鼠均注射β-淀粉样肽（1-40）（Aβ1-40） 所致AD模型。模型组不治疗。加兰他敏组采用氢溴酸加兰他敏灌胃。电针组造模后选取百会、双肾俞、双足三里、大椎等穴位针刺治疗。治疗4周后各组大鼠处死取海马，用免疫组化法和考马斯亮兰法测定AchE、CHAT的表达和含量。 结果 模型组AchE每个视野阳性细胞表达明显增强并且含量[（348.2593±13.0672）IU/g]升高，与正常组、加兰他敏组和电针组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；但模型组CHAT阳性表达减弱且含量低[（81.8543±4.6528）IU/g]，治疗后加兰他敏组[（205.7539±5.9732）IU/g]和电针组增强[（202.5637±5.3695）IU/g），与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 电针通过调节胆碱能神经元的表达，以促进受损神经的恢复和再生。

[关键词] 电针；阿尔茨海默病大鼠；乙酰胆碱酯酶；乙酰胆碱转移酶

[中图分类号] R741 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（a）-0011-03

阿尔茨海默病（AD）是一种多病因产生的渐进性脑功能障碍疾病。主要是在大脑海马区域出现淀粉样物质，即淀粉样 β 蛋白（amyloid β protein，Aβ），Aβ 可以使组织产生大量自由基，干扰钙离子代谢，胆碱能系统损伤，从而引起脑神经元发生改变[1-2]。衡量胆碱能神经元功能的标志是乙酰胆碱转移酶（CHAT），它是乙酰胆碱（ACh）生物合成的关键酶。本研究观察侧脑室注射Aβ1-40所致AD模型大鼠的脑内胆碱能系统中乙酰胆碱酯酶（AchE）及CHAT的影响，对AD的药物研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及分组 清洁级健康Wistar大鼠48只，雄性，体重（250±50）g，白求恩医大实验动物中心提供，合格证号2010002，经水迷宫测试筛选48只，随机分为4组：正常组、模型组、加兰他敏组和电针组，正常组常规饮水和饲料。其余3组大鼠均注射β-淀粉样肽（1-40）（Aβ1-40）所致AD模型，模型组造模后不治疗。加兰他敏组采用氢溴酸加兰他敏灌胃0.5～1 mg/（kg・d），治疗4周。参照实验针灸学[3]，电针组针刺百会、双肾俞、双足三里、大椎等穴治疗，用 0.25 mm×0.25 mm华佗牌无菌毫针针刺，连接DJ-6805型脉冲电针仪，电压为2 V，频率为20 Hz，强度以肢体局部轻微颤动为度，持续刺激20 min，每日1次，连续治疗4周。

1.1.2 主要试剂和仪器 氢溴酸加兰他敏（陕西森弗生物技术有限公司），Aβ1-40 （Sigma公司），AchE、CHAT免疫组化检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），AchE及CHAT测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）、脑立体定位仪、水迷宫、DJ- 6805型脉冲电针仪，Olympus显微镜。

1.2方法

1.2.1 模型复制 10%水合氯醛4 mL/kg麻醉大鼠，在头部做正中矢状切口，坐标为脑表面下3.5 mm，前囟1.5 mm，矢状缝左右旁开1.5 mm。在每侧侧脑室注射，缓慢注入二甲亚砜孵育72 h后的聚集态Aβ1-40（5 μg/μL）各2 μL，创口缝合。

1.2.2 Morris水迷宫实验 根据文献进行水迷宫实验[4]，定位航行试验（place navigation test）：从治疗结束后第1天开始，历时5 d，每天分上、下午各2次，分别从4个不同的入水点，将大鼠于象限边缘1/2弧度处头朝池壁放入水中，记录其2 min内寻找平台所需时间（逃避潜伏期）。若大鼠入水后2 min内未能找到平台，则将其置于平台上并停留10 s，引导学习记忆，逃避潜伏期记录为120 s。空间探索试验（spatial probe test）：实验第6天撤除平台，将大鼠面向池壁从任一入水点放入水池，测试2 min内跨越原平台位置的次数。

1.2.3 取材 实验完成后，每组取6只大鼠麻醉后，打开胸腔暴露出心脏，左心室插入灌注针头，快速灌入无菌生理盐水，剪开右心耳，待右心耳处流出澄清液体，然后灌注4%多聚甲醛，当大鼠尾巴、四肢僵硬时断头取脑，分离海马。一侧海马装入冻存管，一侧置于4%多聚甲醛中，浸泡固定，取海马标本，脱水包埋切片。

1.2.4 免疫组织化学染色大鼠海马AchE和CHAT的表达 采集免疫组化染色图像，用Image-Pro Plus分析软件进行图像分析，每张切片区10个视野测定海马组织中阳性细胞数和平均灰度值，阳性表达越强，平均灰度值越低。所得数据经统计学处理。

1.2.5 考马斯亮兰法大鼠AchE及CHAT活性测定 各组取6只大鼠迅速断头处死，取脑，制成 10%脑匀浆，然后将制备好的脑匀浆以 3000 r/min 离心 10 min，取上清液适量，其中蛋白测定采用考马斯亮兰法测定，操作按试剂盒说明书进行。最后用光度计测定各管吸光度，计算AchE及CHAT的活性。

1.3 统计学方法

计量资料SPSS 17.0系统处理，数计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠海马AchE和CHAT的表达

大鼠海马神经元模型组，AchE染色物平均灰度值明显降低，表明模型组AchE阳性细胞数量增加，与正常组、加兰他敏组和电针组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；但模型组CHAT平均灰度值升高，表明模型组CHAT阳性细胞数量减少，治疗后加兰他敏组和电针组与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1、2，图1。

2.2 考马斯亮兰法大鼠海马AchE和CHAT含量的测定

模型组AchE含量增加，提示AchE活性增强，加兰他敏组和电针组AchE含量下降，模型组与正常组、加兰他敏组和电针组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；但模型组CHAT含量下降，CHAT活性减弱，低于加兰他敏组和电针组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

祖国医学将阿尔茨海默病归于“呆病”、“文痴”、“善忘”、“癫证”、“狂证”等症范畴，痴呆病位在脑，与心、脾、肝、肾等密切相关，而肾精气亏虚、髓海不足为其根本原因[5]，治疗应以补脑髓，畅活气血为主。百会位于巅顶针刺此穴可补益脑髓，宁神开窍之功；肾俞为肾脏气血输注之处，为治疗肾虚、脑髓不足的要穴。故取肾俞可针对AD之本虚，补肾生髓益智。电针肾俞能改善衰老大鼠的学习记忆能力[6]。足三里为足阳明胃经合穴，脾胃为后天之本，针此穴有扶正培元之功； 大椎为督脉之穴，具有统领一身之阳气，联络一身之阴气的作用。而督脉是与脑联系最直接、最密切的经脉，还联系心、肾二脏。所以刺激大椎穴就有调节阴阳、疏经通络，行气活血、祛邪扶正的作用[7]。故而，百会、足三里、肾俞、大椎四穴合用，能标本兼顾，共同改善AD的临床症状。

研究表明AD患者神经生化方面的改变为海马中Ach含量的显著减少，CHAT活性降低，AchE活性增高。而记忆障碍与胆碱能递质缺乏密切相关，胆碱神经功能明显下降，并且其临床表现的严重程度与胆碱能系统功能的损害程度相关[8-9]。AchE的活性变化能反映Ach在脑组织中分解率的变化，AchE的作用是将Ach水解成胆碱和乙酸；相反的，CHAT的活性变化反映Ach在脑组织中合成率的变化。AchE和CHAT二者的共同作用维持着脑组织中Ach含量的动态平衡，反映了Ach的代谢速率[10-12]。AchE参与胆碱能神经递质的传递，当接受到外界刺激时，在钙离子的参与下，囊泡与突触前膜相融合，释放Ach至突触间隙。然后Ach作用于突触后膜的Ach受体，介导信息的传递，参与学习记忆功能的完成[13]。电针可明显改善大鼠的学习记忆能力和脑组织形态学异常，可能与减轻自由基损伤、提高脑ACh含量、抑制神经细胞的凋亡[14]等有关。

本研究观察了大鼠海马组织中AchE和CHAT的表达和活性，发现AD模型大鼠中海马AchE阳性细胞表达明显升高，CHAT阳性细胞明显降低，同时AchE活性升高，CHAT活性降低，这与AD的胆碱能学说相符[15]。通过电针和氢溴酸加兰他敏治疗后AchE阳性细胞表达下降，CHAT阳性细胞增加。本研究说明电针治疗可抑制AchE的表达， 提高CHAT的表达，促进Ach的合成，抑制Ach的分解，增加脑组织的Ach含量，从而改善学习记忆力能力。提示电针通过调节胆碱能神经元的表达和含量变化，促进受损神经的恢复和再生。

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（收稿日期：2013-01-17 本文编辑：冯 婕）