血府逐瘀汤动员大鼠骨髓内皮祖细胞的实验研究

摘要：目的观察血府逐瘀汤动员大鼠骨髓内皮祖细胞迁移，参与血管新生的作用。方法SD大鼠随机分为生理盐水组(对照组)及血府逐瘀汤高、中、低剂量组，灌胃给药8 d后，腹主动脉采血，分离含内皮祖细胞的单核细胞，进行细胞计数；血清中一氧化氮(NO)和血管内皮生长因子(VEGF)含量检测以及流式细胞仪分析细胞表型和细胞周期。结果：虽然各组大鼠骨髓单核细胞数量、增殖能力以及VEGF受体(VEGFR)的表达无统计学意义(P＞0.05)；但药物促进NO的合成和分泌，对VEGF的影响作用正好相反，尤其中、高剂量组影响显著(P＜0.05)；且中剂量组能明显增加CD31的表达为25.20％±0.94％(P＜0.05)。结论：血府逐瘀汤通过NO途径动员骨髓中内皮祖细胞释放，参与血管新生，说明药物能动员骨髓中内皮祖细胞迁移至外周血中，提高循环血中内皮祖细胞的数量。

关键词：血府逐瘀汤；骨髓；内皮祖细胞

中图分类号：R392.5 R285.5　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)09－0829－03

自从1997年Asahara等从外周血中分离出一类能分化成为内皮细胞，参与血管形成的单核细胞，并将之命名为内皮祖细胞(endothehal progenitor cells,EPC)以来，有关EPC与血管新生的关系日益受到重视。在动物缺血模型，外源性细胞因子以及药物的刺激下，骨髓中的EPC司以被动员进入外周循环，定向迁移到血管再生区，直接参与血管损伤后的修复和血管新生过程，在治疗性血管新生方面具有重要的科研价值和良好的临床应用前景。为了探讨血府逐瘀汤在动员骨髓内皮祖细胞方面的作用，开展了一些相关研究，并得到一些初步的结果，现总结报道如下。

1　材料与方法

1．1　动物及分组SD大鼠，(4～5)周龄，体重(100±10)g，雌雄不限，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物批号No 0024493。随机分成生理盐水组(对照组)和血府逐瘀汤高、中、低剂量组，每组6只。

1．2　药物血府逐瘀汤组方：当归9 g，生地9 g，桃仁12 g，红花9g，枳壳60，赤芍6g，柴胡3g，甘草60，桔梗4.5g，川芎4.5 g，牛膝9 g。购自福建中医研究院。该方水煎两次，煎渡过滤，混合后加热浓缩至含生药量1.3 g/mL，4℃保存备用。

1．3　仪器及试剂

1．3．1　仪器倒置式系统显微镜IX70(OLYMPUS公司)，流式细胞仪FACS Cahbur(BD公司)，溶红细胞处理仪(BD公司)，超净工作台(苏州净化设备公司)。

1．3．2　试剂DMEM培养液、大鼠淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物医学工程研究所)、FITC标记的小鼠抗大鼠CD31(Serotec公司)、阴性对照小鼠IgG1－FITC(Serotec公司)、小鼠VEGFR2单克隆抗体(Abcam公司)、FITC标记的羊抗鼠IgG(BD公司)、CycleTESTTM plus DNAREAGENT KIT(BD公司)、一氧化氮(NO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，Lot20070324)和大鼠血管内皮生长因子(VEGF)酶联检测试剂盒(晶美生物公司，Lot 20061120)

1．4　实验方法

1．4．1　给药方法大鼠按体重常规灌胃给药，血府逐瘀汤高、中、低剂量组分别给予药物9.100 g/kg、4.550g/kg(相当于人『临床日用量的7倍)、2.275 g/kg，对照组用等量的生理盐水，每天2次，共7 d。

1．4．2　大鼠外周血中内皮祖细胞的分离第8天在给药后2 h内，采用氯胺酮麻醉大鼠，腹主动脉抽血，肝素抗凝。经DMEM培养液等比稀释后，用密度为1.082 g/mL的大鼠淋巴细胞分离液，1.200 r/min离心20 min分离单核细胞(MNC)，经洗涤、离心形成细胞沉淀后，重新制备细胞悬液备用。

1．4．3　内皮祖细胞表型CD31和VEGF受体(VEGFR)的检测

吸取100μL细胞悬液(细胞浓度≥1×106/mL)，加人10μLFITC标记的小鼠抗大鼠CD31抗体，同时做阴性对照，室温避光孵育20 min，溶红细胞处理仪机洗后，重新悬浮，上机检测血小板内皮细胞黏附分子－1(CD31)。VEGFR的检测采用二抗标记进行。

1．4．4　DNA周期检测采用流式细胞仪进行，具体操作步骤参见试剂盒使用说明书。利用cell Quest软件获取数据，ModiFit分析。

1．4．5　血清NO含量检测采用硝基还原酶法进行，具体操作步骤参见试剂盒使用说明书。

1．4．6　血清VEGF含量检测采用酶联免疫法进行，具体操作步骤参见试剂盒使用说明书。

1．5　统计学处理计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS13.0统计软件包进行组间检验。

2　结　果

2．1　血府逐瘀汤对外周血中单核细胞数量和增殖能力的影响

不同剂量药物组与对照组的单核细胞数量无统计学意义(P＞0.05)，且流式细胞仪的DNA周期分析表明，各组间处于二倍体DNA合成期的细胞很少，细胞相对静止，增殖能力没有显著差别。

2．2　血府逐瘀汤对CD31和VEGFR表达的影响虽然各组间VEGFR的表达没有明显差异，但中剂量组CD31的表达显著升高(P＜0.05)，说明药物能使外周血中内皮祖细胞的数量增加。

2．3　血府逐瘀汤对VEGF，NO合成和分泌的影响随着药物浓度的提高，血清中NO的浓度相应升高，呈明显的量效关系，其中中、高剂量药物组血清中NO的浓度与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，表明药物具有升高血清中NO浓度的作用。血府逐瘀汤对大鼠血清VEGF的合成和分泌的影响正好与对NO的影响相反，中、高剂量药物组血清中VEGF的浓度与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，说明药物抑制VEGF的合成和分泌。

3　讨　论

血府逐瘀汤出自清代著名医家王清任的《医林改错》，原为治疗胸中血府血瘀症而设，其选药精当，组方严密，是目前临床常用的、经典的活血化瘀方剂之一。以往研究工作对其生新方面的机制探讨甚少。在以鸡胚绒毛尿囊膜作为模型的筛选实验中，发现血府逐瘀汤具有显著的促进血管新生的作用。由于内皮祖细胞与血管新生直接相关，本实验从血府逐瘀汤动员骨髓内皮祖细胞参与血管新生的角度，探讨该方剂生新的机制。

血管新生能力与产生NO能力之间呈很强的相关性。NO在动员骨髓中的EPC释放进入外周血，提高循环血中EPC数量这个过程中起到至关重要的作用。骨髓中早期内皮祖细胞被动员进入外周血后，伴随着血循环中内皮祖细胞的分化，会发生表型的变化，逐渐表达出包括CD31等内皮细胞系的典型标志，而且在分化成熟的细胞中，VEGFR的表达增强，出现高表达的特点。本实验结果表明中、高剂量的血府逐瘀汤有明显升高血清中NO浓度的作用，提示该药物通过NO途径在动员骨髓促血管新生中发挥作用。另外，中剂量药物可使外周血中细胞表型CD31的表达显著提高，符合内皮祖细胞被动员的特征变化，进一步证实了药物具有动员骨髓内皮祖细胞迁移，进而促血管新生的作用。

在众多的促血管生长因子中，VEGF与内皮祖细胞的关系最为密切。VEGF作为血管发生的一个中枢调节因子，通过VEGF受体－2(VEGFR－2)对EPC的分化、成熟及血管形成起着至关重要的作用。但本实验中血府逐瘀汤抑制VEGF的合成和分泌，且VEGFR的表达没有变化，这可能与药物能显著提高NO的表达有关。NO作为细胞内和细胞间的信号分子，具有广泛的生物效应，NO在血管新生中的作用是双向性的，在动物实验中可表现出矛盾的效应，对于VEGF基因表达可以呈抑制作用，也可以呈刺激作用，取决于细胞的类型和环境，并与组织、细胞对缺氧的适应程度有关。本实验采用的动物为正常幼年大鼠，不存在病理上的缺血和缺氧现象，这是否导致药物升高NO但抑制VEGF的表达，还有待进一步的实验证实。