大鼠高眼压动物模型中视网膜热休克蛋白70的表达及其热耐受的调节作用

[摘要]目的：探讨大鼠急性高眼压后视网膜神经节细胞HSP70的表达，并给予预先的热刺激(热休克)，观察热休克对视网膜神经节细胞HSP70表达的调节。方法：56只Spragne-Dawley(SD)大鼠随机分为高眼压组、水浴＋高眼压组，右眼为实验眼。高眼压组：右眼前房穿刺，BBS灌注产生102mmHg静水压持续加压2h。水浴＋高眼压组：给大鼠体温提高至40.5～41.5℃/10min诱导出热耐受，3h后再给予前房穿刺，产生102mmHg静水压持续加压灌注2h。免疫组化法测定视网膜神经节细胞HSP70的表达强度。结果：正常大鼠视网膜神经节细胞可见少许HSP70的表达，高眼压组及水浴＋高眼压组均在4小时后视网膜经节细胞HSP70的表达增加，12小时后达高峰，24小时后开始回落，水浴后大鼠视网膜神经节细胞HSP70的表达基础水平提高。结论：热应激能诱导大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)内源性HSP70的表达，从而提高RGCs对急性高眼压的耐受性，起到保护视神经的作用。

[关键词]热休克蛋白质 视网膜神经节细胞 高眼压 热耐受 免疫组化

热休克蛋白(heal shock protein，HSP)是一组所有的细胞能在应激情况下由热休克基因所编码合成的序列高度保守的伴随细胞蛋白，并能对抗更为严重的应激损伤，这种现象称为热休克反应(heat shock response，HSR)[1]。目前认为热休克反应是细胞对各种不利因素刺激所表现的一种以基因表达和调控方面发生改变的反应。目前的研究发现高温、缺氧、再灌注局部损伤或感染等多种有害因素刺激均可产生热休克蛋白[2]。

HSP通常按分子量大小进行分类，主要有HSP70、HSP90、HSP60以及小分子HSP[3]。在HSP家族中，HSP70与神经保护有着最为密切的联系。研究发现高热诱导HSP合成后具有保护光感受器免受光损害的作用[4]。而热耐受是否可以提高在体眼急性高眼压视网膜HSP70的表达而减少组织细胞的损伤，目前尚未见报道。为此，本研究在眼急性高眼压动物模型建立的基础上，研究眼急性高眼压后视网膜HSP70的动态表达情况以及热耐受后对在体眼急性高眼压视网膜HSP70表达的调节，为急性青光眼的药物防治提供相关理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60只清洁级Sprague―Dawley(SD)大鼠，鼠龄2～3周，雌雄不限，体重50～100g。实验前散瞳并行裂隙灯显微镜检查排除角膜病、葡萄膜疾病、晶状体及玻璃体等疾病。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗鼠HSP70单克隆抗体(浓缩型)，S-P超敏免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，均购自福州迈新公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物

(1)分组：56只SD大鼠随机随机分为2组，分别为高眼压组、水浴+高眼压组。每组28只，右眼为实验眼。①高眼压组组：28只，随机分成7个亚组，每组4只。分别为：A：不予高眼压立即取材组；B：高眼压后立即取材组；C：高眼压后2 h取材组；D：高眼压后4 h取材组；E：高眼压后12 h取材组；F：高眼压后24 h取材组；G：高眼压后36h取材组。②水浴+高眼压组：28只，随机分成7个亚组，每组4只。分别为：A：水浴后立即取材组；B：水浴+高眼压后立即取材组；C：水浴+高眼压后2 h取材组；D：水浴+高眼压后4 h取材组；E：水浴+高眼压后12 h取材组；F：水浴+高眼压后24 h取材组；G：水浴+高眼压后36 h取材组。 (2) 急性高眼压模型制作方法及水浴方法：急性高眼压模型按贾莉君等[5]介绍的方法，具体步骤如下：大鼠予10％水合氯醛3mg／kg体重腹腔内注射麻醉后固定在鼠用立体定位仪上，用4号半一次性输液针头作右眼前房穿刺，经一次性消毒输液器连接乳酸钠林格氏液输液瓶，将液面高度调整至距实验眼水平面1387mm，使之产牛102 mmHg静水压，在大鼠右眼前房内持续加压灌注，2 h后拨出针头，大鼠自行苏醒。水浴时将SD大鼠麻醉后置于45℃ 恒温水中，肛温表测量其直肠温度达40.5～41.5℃ ，维持10 min，常温下置放3 h后制高眼压模型。

1.3.2 取材和切片

戊巴比妥钠按35mg/kg 行大鼠腹腔注射，待大鼠深度麻醉后，将大鼠固定于手术台上。剪开大鼠胸部皮肤及胸廓组织后，暴露出心脏，剪开左心室尖，插入供灌注用的9号灌注针头至升主动脉，止血钳夹闭主动脉并固定灌注针头，先用生理盐水l00mL以40mL/min 速度推注，后快速推注40g/L的多聚甲醛200mL左右(防止视网膜神经节细胞变性)，直到大鼠全身僵硬。完整取出大鼠的左右眼球，分别放入40g/L 的多聚甲醛中，30min后用前房穿刺刀穿刺前房，2h后将角膜、晶状体剔去(大鼠的玻璃体极少)制成眼杯，再将眼杯继续固定4～6h，取出眼杯后依次梯度洒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，同一标本连续切出3～4张厚度为5um的切片，免疫组化使用。

1.3.3 免疫组化染色

石蜡切片常规脱蜡、水化；加3％ H2O2室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；加1：100稀释的HSP70单克隆一抗，阴性对照用PBS代替一抗，37℃温育30min；加聚合物增强剂室温下孵育20 min；加酶标抗鼠／兔聚合物，室温下孵育30min；加新鲜配制的DAB显色液显色3～10min，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗，苏木素复染40s，lg/L 盐酸酒精分化2s，自来水冲洗返蓝l5min；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3.4 免疫组化结果判定

光镜下观察胞浆或胞核内呈现不同程度的棕黄色粗大颗粒反应者为抗HSP70抗体染色阳性细胞，反之染色阴性。每份标本取一张未复染切片，每张切片随机取3个视野，应用LeicaQ5OOMC图像分析仪对阳性反应部位进行平均灰度和面密度分析。灰度值采用Median(QR)表示，记录相应数据，取平均值作为该标本的结果，结果进行统计分析。

1.4 统计学分析方法

实验中HSP70表达强度的统计数据采用SPSS 13.0软件进行分析 。对两实验组(高眼压组和水浴＋高眼压组)间、两组的A-F亚组结果之间的比较采用两因素析因方差分析(即组别、时段两因素)，A组和其他各亚组间的比较采用Dunnett-f检验，两实验组同一亚组间的比较采用t 检验，以P

2 结果

免疫组化结果：图1为正常视网膜组织切片光镜下的神经节细胞，免疫组化显示棕黄色颗粒位于视网膜神经节细胞(RGCs)胞浆内(图2、图3、图4)，其余各层均未见明显表达，各组及亚组图像分析平均灰度值Median(QR)见图5。

通过析因分析，显示高眼压组与水浴+高眼压组两组组间、不同亚组间HSP70表达强度比较，差异有统计学意义(组间及亚组间P值均小于0.01)。高眼压组和水浴+高眼压组HSP70 蛋白的表达强度均于高眼压后4 h开始增强(与各自A组相比行Dunnett-t检验，P=0.00)， 24后h达到高峰， 36小时后回落，但仍高于正常组(与各自A组相比行Dunnett-t检验，P=0.00) 。

水浴后大鼠视网膜神经节细胞HSP70的表达基础水平提高，水浴＋高眼压组A～F各亚组的HSP70表达强度均较相应高眼压组高，差异均有统计学意义(t值分别为-4.25，-5.78，-l1.05，-8.31，-7.29，-6.77，-4.31；其P值均小于0.05)。36 h后水浴＋高眼压组的HSP70表达强度虽然回落，但与高眼压组相比，差异仍然有统计学意义(t=-6.77，P

3 讨论

近年来，抗青光眼手术设计日臻完善，加之各种高效降眼压药物的开发和应用，将青光眼患者的眼内压控制在靶眼压以内不再象以前那样困难，但即使是最大限度地降低了眼内压，仍不能阻止部分患者视功能恶化。另外，正常眼压性青光眼患者的眼内压正常，发病机制不清，降眼压治疗缺乏针对性，视神经保护的研究成为研究的热点和难点。

热休克蛋白与青光眼视神经保护的研究日益受到重视，而在HSP家族中，作为与神经保护联系最密切的HSP70，其保护视神经的机制包括：（1）通过分子伴侣作用在蛋白质代谢过程中发挥着极其重要的作用。分子伴侣作用的主要功能包括：帮助新合成蛋白质的折叠，防止其互相聚集；帮助蛋白质的细胞内移位；帮助变性蛋白质复性以及清除严重受损的蛋白质[6]。（2）帮助细胞对抗凋亡刺激因素侵袭，这些因素有热休克、肿瘤坏死因子、生长因子、氧化应激、化疗药物、宇宙辐射等。所有HSP中，HSP70是凋亡的主要抑制者[7,8]。（3）保护线粒体使之免受活性氧族的毒害作用的作用[9]。

本实验模拟青光眼高眼压环境，探讨急性高眼压条件下RGCs与HSP70表达的关系。结果表明在前房内加压灌注时，眼内压急剧升高；当眼内压超过大鼠尾动脉压的75％(102 mmHg)时，视网膜动静脉血流由于机械受压停止，RGCs处于缺血和机械受压应激状态下，在缺血再灌注4小时后细胞内HSP70的表达增加,并逐渐加强 ,到24小时达到高峰，36小时后开始减少。HSP70的表达呈峰时出现亦说明HSP70作为一种应激蛋白，其蛋白保护作用具有时间依赖性。

本实验还探讨了热耐受对RGCs的HSP70表达的调节作用。 热耐受(thermotolerance)作为HSP的一个重要生物学功能，是指细胞经过预先的热休克处理后诱导HSP的合成，使细胞能够耐受一个更为强烈的热处理。Caprioli[10]等研究提示通过热耐受可以提高视网膜细胞的耐热能力，从而减少组织细胞的损伤。本实验采用45℃ 温水浴的方法，通过温水浴加热大鼠，使热量均匀传导至全身。由于热耐受与HSP表达有关，因此若要产生热耐受，则第2次的应激一般要在第1次热休克恢复期，有研究显示[11]大鼠热休克后恢复37℃ 2―3 h再给予第2次的应激是必要的。因此本实验在给予第二次应激时，予常温恢复是必须的。本实验结果显示HSP70表达的峰值时间高眼压组与水浴组一致，但水浴组的转录强度均高于高眼压组，差异有统计学意义。

本研究结果证实，热应激能诱导RGCs内源性HSP70的表达，从而提高RGCs对急性高眼压的耐受性，起到保护视神经的作用。

参考文献

[1] PelhaⅡl H．Heat shock protein：coming in from the cold． Nature,1988,332：776-777.

[2] Dzaman-Serafin S, Telatyska-Mieszek B, Ciechanowski K.Heat shock proteins and their characteristics.Pol Merkur Lekarski. 2005 Aug;19(110): 215-9.

[3] Morimoto RI，Tissieres A,Georgopoulos C.The stress response, function of the proteins and perspectives. In: Stress Proteins in Biology and Medicine. New York：CPHL Press, 1990: 1670-1678.

[4] Barbe M, Tytell M, Cower DJ, et al. Hyperthermia protects against light damage in the rat retina. Science, 1988, 241：l8l7-l820.

[5] 贾莉君, 刘忠浩, 罗学港等. 青光康注射液对急性实验性高眼压大鼠视网膜节细胞代谢的作用[J]. 中华眼科杂志，1995，31(2)：129―132．

[6] Kampinga HH, Kanon B, Salomons FA, et a1. Overexpressionof the cochapemne CHIP enhances Hsp70 dependent folding activity in mammalian cells. Mol Ccll Biol, 2003, 23(14)：4948- 4958.

[7] 陈惠黎. 生物大分子的结构和功能[M]．上海: 上海医科大学出版社. 1999, 3(1)：l96.

[8] Javid B, Macary PA, Lehner PJ. Structure and Function: Heat Shock Proteins and Adaptive Immunity. J Immunol. 2007 Aug 15;179(4):2035-2040.

[9] Hartel FU. Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature, l996, 38l:57l-579.

[10] Caprioli J，Kitano S，Morgan JE．Hyperthermia and hypoxia increase tolerance of retinal gangle cells to anoxia and excitotoxicity．Invest OphthalmolVis Sci．1996,37：2376-2381．

[11] Stojaclnovic KJ，Smallridge R，Galloway R，et a1．Induction of heat―shock protein 72 protect against ischemia／reperfnsion in rat small intestine．Gastroenterology，1995，109：505-515.