miRNA和肿瘤产生的相关性研究

摘 要 目的：研究miRNA和肿瘤产生的相关性，探讨其能否成为肿瘤产生的指标和miRNA在肿瘤中的作用机制及临床意义，为发现肿瘤的产生原因、预后评估和miRNAs相关治疗新靶点提供理论依据。方法：回顾性分析收治的45例肿瘤患者的临床资料，取AB两组，一组为肿瘤病患者，一组为相应的非病患裸鼠。取患者身上相应的癌细胞，再取裸鼠身上的相应的正常细胞。对45例癌标本进行免疫组织化学染色分析。运用实时定量PCR，比较癌细胞系与正常组织间的相应miRNA区别。对45例癌患者和45例正常对照者运用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法对miRNA的多态性进行分型，分析这个位点的等位基因频率。结果：95%miRNA在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度的上调或下调，变化均有统计学意义。结论：这一现象初步解释了肿瘤发生与miRNA表达之间存在相关性。

关键词 miRNA 肿瘤 相关性

MicroRNA(miRNA)作为一类非编码蛋白质，分布广泛，具有调控基因表达的作用［1］。生物信息学研究显示，单个miRNA对数百个靶基因可以进行调节，这表示所有的信号途径可能会被miRNA影响。本文就miRNA和肿瘤产生的相关性做一初步探讨。

资料与方法

回顾性分析今年上半年收治的45例肿瘤患者的临床资料，其中肺癌患者20例，白血病患者15例，淋巴瘤患者10例。

方法：取A、B两组，一组为肿瘤患病者，一组为相应的非病患裸鼠。取患病者身上相应的癌细胞，再取裸鼠身上的相应的正常细胞。例如肺癌患者，取肺部癌细胞，再裸鼠的肺部细胞。对45例癌标本进行免疫组织化学染色分析。运用实时定量PCR，比较癌细胞系与正常组织间的相应miRNA区别。对45例癌患者和45例正常对照者运用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法对miRNA的多态性进行分型，分析这个位点的等位基因频率。在miRNA为杂合子的3种癌细胞株中，运用双荧光标记实时定量-PCR方法(Real-time PCR)对于2个等位基因分别相应的miRNA进行定量比较。运用SPSS 15.0统计软件的Logistic回归、Kaplan-Meier曲线、Cox多因素回归等模块分析上述结果与临床资料的联系。

结 果

在癌组织中相应的miRNA的免疫组织化学染色分析表明，高Gleason评分的癌组织较低Gleason评分的癌组织染色强度降低。各组间染色分析结果表明PSA≥100。A组较其他PSA组别染色阳性率减少(P=0.010)；A组较其他分期组别染色阳性率增多(P=0.021)；Gleason评分B组较A组染色阳性率降低(P=0.031)；运用多变量Cox成比例危险因子模型分析表明，阴性miRNA的染色结果是在伴生化复发或肺癌特异性生存的独立预测因素(OR 2.143，95%CI 1.035～4.132；OR 2.365，95%CI 1.194～5.485)。实时定量PCR结果表明，miRNA表达量在肺癌细胞系中较正常肺部组织显着降低，miRNA与原癌基因存在显着负相关(r=-0.678，P＜0.001；r=-0.670，P＜0.001)。研究结果证实，miRNA与肺癌进展为负相关，可能发挥着抑制癌进展的作用。45例癌患者和45例对照组对miRNA运用PCR-RFLP进行分型，含有基因Dicer与肺癌发生转移(D期)的相关性具有统计意义(P=0.010)，Dicer基因型发生肺癌转移的危险性增高(aOR 1.906，95%CI 1.166～3.115)。Dicer基因型在发生病理高分级的危险性增高(aOR 1.646，95%CI 1.076～2.517)。生存分析表明：Dicer基因型在初诊为D期患者的肺癌特异性生存时间显着缩短(P=0.007)；在进行癌细胞清除术后的患者中，Dicer基因在肺癌复发时间显着缩短(P=0.002)。多变量Cox成比例危险因子模型表明，Dicer基因型是预后的独立预测因子(HR 4.658，P=0.019)。研究结果证实，Dicer基因在miRNA结合位点的肺癌的转移及复发具有重要作用。结合通过miRNA与靶基因预测网站分析发现，运用双荧光标记的实时定量PCR，结果表明癌细胞较正常细胞产生的mRNA水平明显升高或降低。发现：①在肺癌中发现Dicer的表达下调，抽查70个非小细胞肺癌样品其中DROSHA及DICER的miRNA表达情况。检测结果显示术后存活期缩短与DICER的表达量下降关联，说明肺组织的转化也许是Dicer阻止的。研究证明缺乏Dicer的鼠胚胎干细胞虽然会产生异染色质不足的情况，但其结果不会导致染色体的结构或者数目不正常。即使注射缺乏Dicer的胚胎干细胞至裸鼠中并不会有肿瘤发生的可能。所以，Dicer也许是非直接作用于肿瘤的发生，具有肿瘤抑制因子效应的miRNA的减少可能是通过其缺失而导致的。上述研究证实了此基因在哺乳动物发育和四肢形成、T细胞发育、干细胞正常分化的重要地位，提示在此过程中起着重要作用的是成熟的miRNA。故Dicer和肺癌的联系证明了这个基因是通过miRNA来影响肺组织分化的。②在慢性B淋巴细胞白血病中miR-15a和miR-16a-1表达下调，并且编码这两种miRNA基因的染色体区域13q14有50%以上是发生缺失的。进一步研究发现，miR-15a和miR-16a-1是BCL2基因的反义作用因子。这两种miRNA可通过抑制BCL2蛋白的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。当这两种miRNA表达下调或缺失时，对转录后水平BCL2的负调节作用降低，致使BCL2的表达升高，促使发生白血病。③miR-15a与miR-16-1有调控BCL2作用，它是抗凋亡基因，在许多肿瘤中过度表达，miR-15a和miR-16-1的下调或缺失，使得BCL2表达上升，促使产生淋巴瘤。

讨 论

miRNAs是在动植物中新发现的一大类基因表达调控因子，miRNAs主要借助诱导RNA介导(RNAi)的干扰途径对其进行干扰［2］。在植物中，此种miRNA介导的基因沉默机制相对常见，于哺乳动物中也偶可看到。实际上，哺乳动物中的绝大部分miRNAs不会降解靶mRNA，有其他机制调控基因表达［3］。于转录后的水平上，所有miRNAs主要借助mRNA的3’非翻译区(UTRs)与非完全碱基配对，在等同或类似于RNA干扰途径中所使用的RISC复合物中，抑制基因翻译。同样经抑制翻译的miRNAs只是减少其靶基因的蛋白质表达水平，并不影响mRNA水平［4］。实际上miRNAs与其靶基因仅部分互补也会起降解mRNA的作用，有待研究的是，翻译抑制的发生时机是在mRNA降解的前还是后。由RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)转录而成的miRNAs，称之为pri-miRNA的前体分子是初始产物。细胞核内的pri-miRNAs被双链RNA 结合蛋白Pasha及RNase Ⅲ Drosha改造为一个约由70个核苷酸构成的具有不完全的茎环分子结构的pre-miRNA。GTP与RAN所依赖的exportin 5 将此前体分子输入细胞质。然后另一个RNase Ⅲ Dicer把茎环结构剪切成约22个核苷酸长度的miRNA：miRNA*双链，双链和miRISC复合体相整合，成熟的miRNA即保留于具有功能的复合物中反向调控靶基因的表达。人类中的大多数其miRNAs在非编码蛋白或编码蛋白的mRNA 转录本的内含子区域，其余或在mRNA非编码的外显子区域，或在基因组的转录本之间，或在mRNA3’非翻译区域［5］。也有一些miRNAs聚成一个miRNA基因簇，如19号染色体上的54个miRNAs 聚成了一个基因簇［6］。可以借助序列同源性的规律对miRNAs进行分组和归类。miRNAs在癌症中起重要作用，miRNAs充当基因调节器作用，能够调控细胞生长、分化和凋亡。在许多人类肿瘤病例中，都发现miRNA表达异常，要么是在成熟的miRNAs，要么是在前体miRNAs，或者二者皆有。因此，miRNAs表达水平的改变在肿瘤形成中也起重要作用［7］。与正常组织相比，虽然在肿瘤组织中大多数miRNAs表达都下降，但是也有高表达的miRNAs被发现。鉴于此，miRNA基因被认为既充当肿瘤抑制基因也充当癌基因角色。

参考文献

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