血清IL-18BP水平及外周血单个核细胞IL-18BPmRNA的表达水平与HBV宫内感染的相关性研究

【摘要】目的 通过研究HBV宫内感染组与未感染组之孕妇血清HBV含载量（HBV-DNA）、IL-18结合蛋白(IL-18BP)分泌水平及外周血单个核细胞IL-18结合蛋白RNA(IL-18BPmRNA)表达水平的差异，探讨IL-18结合蛋白、IL-18结合蛋白mRNA与HBV宫内感染的相关性及其临床意义。方法 选择2010年1月至2010年12月在我院分娩，患乙肝大三阳的单胎足月妊娠孕妇，检测其新生儿脐带血HbsAg和HBV-DNA，诊断HBV宫内感染孕妇30例作为研究组，未发生宫内感染孕妇随机抽取60例作为对照组。分别用ELISA定量法及逆转入聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测90例孕妇血清HBV-DNA、IL-18BP水平及外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平。结果 1、HBV宫内感染组孕妇外周血清HBV-DNA较未感染组孕妇显著升高，而外周血清IL-l8BP分泌水平、外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平则显著降低，两组差异有统计学意义（P＜0.01）。2、血清HBV含量与IL-l8BP分泌水平及外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平均呈负相关性；外周血清IL-l8BP分泌水平与外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平呈正相关性。结论 HBV宫内感染孕妇体内HBV病毒复制活跃；HBV宫内感染与孕妇外周血IL-18分泌下降有关，IL-18BP是一种能够与IL-18以高亲合力特异性结合，并拮抗IL-18相关生物学功能的蛋白因子，其表达水平受IFN-γ的调节，IFN-γ上调IL-18BPmRNA的表达，IL-18、IFN-γ、IL-18BP、IL-18BPmRNA组成一个负反馈机制，IL-18BP、IL-18BPmRNA参与IL-18水平的调节，并能间接反映IL-18水平，IL-18BP、IL-18BPmRNA水平降低提示有HBV宫内感染可能。

【关键词】肝炎病毒 疾病传播/垂直 IL-18BP IL-18BPmRNA

中图分类号：R512.62 文献标识码：B 文章编号：1005-0515（2012）1-036-02

我国是乙型肝炎的高流行区，人群乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带率高达10%～20%，其中40%～50%通过母婴垂直传播。而宫内感染是母婴垂直传播的主要途径。近年研究资料证明：HBV宫内感染率为9.1%-36.7%[1]。我们的前期研究显示HBV宫内感染与孕妇外周血IL-18分泌下降有关，IL-18水平下调可能是HBV宫内感染的危险因素之一[2]。白介素-18结合蛋白(IL-18BP)是1999年确定的一种能够与IL-18以高亲合力特异性结合，并拮抗IL-18相关生物学功能的蛋白因子。本文通过检测HBV宫内感染组与未感染组孕妇血清HBV-DNA、IL-18BP水平和外周血单个核细胞(PBMC)内IL-18 mRNA的表达水平, 探讨HBV-DNA、IL-18BP、IL-18BP mRNA与HBV宫内感染的相关性及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2010年1月至2010年12月在江西省妇幼保健院完整产前检查并分娩的，患乙肝大三阳（HbsAg、HbeAg及HbcAb三项阳性）且肝功能正常，无其它妊娠并发症及合并症的单胎足月妊娠孕妇，其丈夫排除HBV携带，分娩即刻采集新生儿脐带血检测乙肝两对半和HBV-DNA，诊断HBV宫内感染孕妇30例作为研究组，未发生宫内感染孕妇随机抽取60例作为对照组。孕妇年龄、孕产次、胎龄、新生儿性别及分娩方式两组比较均无统计学差异(P＞0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集及保存 采集患乙肝大三阳孕妇空腹外周血3管各3ml，1管用于检测HBV-DNA，2管用自动离心机3000r/min离心30min，分离血清及单个核细胞，置于去RNA酶EP管-80℃液氮中保存，等待检测IL-18BP、IL-18BPmRNA。分娩即刻采集新生儿未注射乙肝免疫球蛋白及乙肝疫苗脐带血2ml，用于测乙肝两对半及HBV-DNA。

1.2.2 检测方法 （2）新生儿血清乙肝两对半测定：采取ELISA法，试剂由中山生物工程有限公司提供，按说明书操作；（1）孕妇及新生儿血清HBV-DNA检测：用荧光定量PCR法，试剂中山大学达安基因股份有限公司提供，按说明书操作；（3）孕妇血清IL-18结合蛋白测定：试剂由北京天更生物试剂提供，所用Labsystems MK3型酶标仪及可调多道移液器(5～200uL)为芬兰Thermo Labsystems公司产品，DNX-9620电脑洗板机由北京普朗新科技有限公司生产，按说明书操作；（4）孕妇外周血单个核细胞内IL-18 mRNA测定：（i）IL-18BPmRNA提取：RNA提取试剂盒（离心柱）由北京天更生物试剂提供，按说明书操作；（ii）荧光定量PCR的操作步骤：引物设计，查IL-18BPmRNAα基因序列：NM_173042，引物设计如下：hIL-18bpF CTGGGCAATGGTTCCTTCA；hIL-18bpR CTGTTCAGGGTCCACGAGC（171bp），引物探针由韩国 BioNeer公司提供；反转录反应条件的设置：25℃10分钟 42℃60分钟，85℃5分钟；荧光定量PCR扩增条件的设置：94℃4分钟；94℃20秒 60℃30秒 72℃30秒循环35次，72℃检测信号，荧光定量PCR试剂盒由韩国 BioNeer公司提供，严格按说明书操作。

1.3 HBV宫内感染诊断标准：新生儿脐带血HBsAg和/或HBV-DNA阳性(HBV-DNA＞1.00×103拷贝/ml为阳性）。

1.4 统计学处理 应用SPSS l1.0软件分析数据，结果以(x±s)表示，用卡方检验、t检验以及spearman相关性分析进行统计学分析。

2 结果

2.1 两组病例血清HBV-DNA、IL-18BP水平和PBMC内IL-18BPmRNA的表达水平

HBV宫内感染组（研究组）孕妇外周血清HBV-DNA水平较未感染组（对照组）孕妇明显升高，而外周血清IL-l8BP分泌水平、外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平则显著降低，两组差异有显著统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 两组病例血清HBV-DNA、IL-18BP和PBMC内IL-18BPmRNA水平变化（x±s）

2.2 两组病例血清HBV-DNA、IL-18BP水平和PBMC内IL-18mRNA的表达水平的相关性分析 从散点图上看，无论是对照组还是研究组，两个量的线性关系都不明显，所以下面用spearman秩相关系数来判断它们相关性。

血清HBV-DNA与IL-l8BP分泌水平呈负相关性，r=-0.322和-0.513；血清IL-l8BP分泌水平与外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平呈正相关性，r=0.724和0.640；血清HBV-DNA与外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平呈负相关性，r=-0.460和-0.410。见表2。

表2 血清HBV-DNA、IL-18BP水平和PBMC内IL-18mRNA的表达水平的相关性

3 讨论

3.1 孕妇体内HBV病毒活性与HBV宫内感染 HBV母婴传播是HBV传播的主要途径之一，其中宫内感染是最主要的母婴传播方式。血清HBV-DNA是反映病毒在体内复制和宿主传染的直接指标。多数学者认为随着孕妇血清HBV-DNA含量的升高宫内感染率逐渐增高，病毒高含载量是HBV宫内感染的高危因素之一。本研究显示HBV宫内感染组（研究组）孕妇外周血清HBV-DNA水平较未感染组（对照组）孕妇明显升高，两组差异有显著统计学意义（P＜0.01），支持该观点。高水平的HBV感染可能刺激机体免疫系统活化，并释放大量细胞因子，通过抑制IFN-γ引起Th1/Th2细胞免疫失衡，使孕妇抗病毒能力下降，HBV复制活跃，HBV宫内感染风险加大。魏俊妮等提出孕妇血清HBV-DNA含量可能存在导致HBV宫内感染发生的界值，当HBV DNA含量达到这一水平宫内感染率将发生显著变化，而控制孕妇血清HBV DNA含量至这一界值之下，将有利于降低HBV的宫内感染率[3]。

3.2 孕妇血清IL-18BP水平和PBMC内IL-18BPmRNA的表达水平与HBV宫内感染 郑九生等[2]在国内首次报道了HBV宫内感染与孕妇外周血IL-18分泌下降而导致其Th1/Th2免疫失衡有关，推测IL-18水平下调可能是HBV宫内感染的危险因素之一。IL-18是一种前炎性细胞因子，又称干扰素诱导因子，可以刺激IFN-γ、GM-CSF及IL-2产生，增强NK细胞毒作用和诱导Th1介导的免疫反应，增强机体抗肿瘤、抗病毒、抗细菌能力。白介素-18结合蛋白(IL-18BP)是1999年确定的一种糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，能够与IL-18以高亲合力特异性结合，并抑制IL-18相关生物学功能，被认为是IL-18的天然拮抗剂。IL-18BP以早期Th1细胞因子抑制剂的形式参与Th1应答的调控[4]。另外, IL-18BP通过与IL-18竞争性结合以阻断IL-18通过细胞表面受体向细胞内传递信号,从而抑制IL-18依赖性IFN-γ的产生[5]。通过抑制IFN-γ而增加天然的以及IL-1β诱导的PGE2产量，而PGE2能促进树突状细胞和Th0细胞的Th2应答, 并抑制T细胞产生Th1相关的细胞因子[6]。IL-18BP基因在多种组织和细胞中均有表达，其表达水平受IFN-γ的调节，IFN-γ上调IL-18BPmRNA的表达，IFN-γ又受IL-18调节， IL-18、IFN-γ、IL-18BP、IL-18BPmRNA组成一个负反馈机制。

本研究显示：HBV宫内感染组（研究组）孕妇外周血清IL-l8BP分泌水平、外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平较未感染组（对照组）孕妇显著降低，两组差异有显著统计学意义（P＜0.01）。mRNA表达的量与受体蛋白的量不是简单的线性关系，生物体内对于转录后调控机制及翻译机制是很复杂的，目前也尚未彻底研究清楚。本研究无论是对照组还是研究组，其线性关系都不明显，但是用spearman秩相关系数来判断它们仍有相关性：血清HBV-DNA与IL-l8BP分泌水平呈负相关性，r=-0.322和-0.513；血清IL-l8BP分泌水平与外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平呈正相关性，r= 0.724和0.640；血清HBV-DNA与外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平呈负相关性，r=-0.460和-0.410。郑九生等[2]研究显示HBV宫内感染与孕妇外周血IL-18分泌下降有关，IL-18分泌水平下降，导致IFN-γ水平下降，通过下调IL-18BPmRNA的表达，减少IL-18BP的分泌，从而降低对IL-18生物活性的抑制。通过IL-18、IFN-γ、IL-18BP、IL-18BPmRNA的负反馈机制进行调控，IL-18BP升降实际上是对IL-18生物活性最重要的、最恰当的适应性反应。IL-18BP、IL-18BPmRNA参与IL-18水平及活性的调节，并能间接反映IL-18水平及活性，IL-18BP、IL-18BPmRNA水平降低提示有HBV宫内感染可能。

3.3 IL-18BP与IL-18BPmRNA在预防HBV宫内感染中的应用前景 IL-18BP基本无毒，并发症少，且IL-18BP只专一地结合并阻断IL-18的作用。IL-18作为一种炎症因子、在乙型病毒性肝炎的肝损害中发挥重要作用；同时在清除HBV过程中也发挥重要作用[7]。已有报道IL-18BP在IL-18介导的炎性疾病中发挥了重要的调控作用[8]，国外有学者应用IL-18BP在动物实验中预防IL-18介导的肝损害[9]。IL-18参与了多种有关炎症和自身免疫疾病，利用IL-18调节Th1/Th2型细胞免疫平衡的功能，用作乙肝病毒核酸疫苗佐剂，单独或联合其他免疫增强剂进行抗病毒基因免疫治疗已有研究报道，但是临床上能否应用IL-18治疗慢性无症状携带者以图消除免疫耐受，甚至通过调节IL-18表达水平减少HBV宫内感染仍在研究中。IL-18的临床应用仍有待于进一步探讨。本研究设想可以通过减少IL-18BPmRNA的表达水平，减少IL-18BP的分泌，或直接降低IL-18BP的活性，降低对IL-18生物活性的抑制，以提高内源性IL-18的活性达到治疗目的；在使用内源性或外源性IL-18治疗中，IL-18BP可用于预防IL-18水平相对或绝对过高造成的肝脏损害，减少并发症的发生，使患者得到安全有效的治疗。IL-18BPmRNA、IL-18BP即可应用直接或间接治疗或预防HBV感染，有可在HBV治疗中预防肝脏损害，具有广阔的开发前景；但机体的免疫调控机制十分复杂, IL-18BPmRNA、IL-18BP水平控制、生物活性的调节以及IL-18mRNA、IL-18BP、IL-18之间是怎样维持平衡的，有效治疗方式、剂量、疗程等仍有待进一步研究。

参考文献

[1]乐杰主编，妇产科学，第7版，北京，人民卫生出版社，2008.01.145-149.

[2]郑九生，彭凯欣，周小飞，等.乙型肝炎病毒感染孕妇IL-18对Th1/Th2细胞免疫平衡的作用与胎儿宫内感染相关性研究.现代妇产科进展，2007，16（9）：684-668．

[3]魏俊妮，王素萍，李小燕，等.乙肝母亲HBV-DNA含量及肝功能与其新生儿HBV宫内感染的关系.现代预防医学，2010.37（11）：2034-2038.

[4]Aizawa Y, et al. Cloning and expression of interleukin-18 binding protein[J]. FEBS lett. 1999, 26,445(2-3)：338-342.

[5]刘文强，刘桂芹，秦绪岭等.重组IL-18BP拮抗重组鸡IL-18刺激外周血单核细胞产生IFN-γ的作用.微生物学报，2010.50(4)：506－511.

[6]Reznikov L et al. Proc Natl and Sci USA, 2000,97(5): 2174.

[7]李曼妮，苏先狮，杨春艳.乙型肝炎患者血清IL-18水平与HBV感染的关系.中国医师杂志.2004年4月第6卷第4期：476-477.

[8]杨汉正，吴建成，成玉生，史卫红.IL-18结合蛋白在慢性肝炎及肝癌中的表达意义.第四军医大学学报.2008.29(21)：2005-2007.

[9]Lee S, Kim S, Bae S, Choi J,Development of isoform-specific monoclonal antibodies against human IL-18 binding protein.Hybridoma (Larchmt). 2010 Dec;29(6):517-24. Epub 2010 Nov 18.