水银花中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙含量测定方法

【摘要】日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，带自动进样器， ELSD-LT Ⅱ蒸发光散射检测器，LC solution色谱工作站；Waters2695高效液相色谱仪，带自动进样器，Alltech ELSD 2000ES蒸发光散射检...

摘要：目的 建立水银花中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量测定方法。方法 对高效液相色谱法（HPLC）的色谱条件进行摸索，并采用正交设计法考察供试品溶液的制备条件。结果 HPLC色谱条件为：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈（A）-0.4%醋酸（B）梯度洗脱，流速1.0 mL/min。样品供试液制备条件为：药材破碎度过四号筛，药材称样量为0.4 g，甲醇浓度为50%，提取时间为40 min。结论 建立的HPLC含量测定方法准确可靠，可作为水银花中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总量的测定方法。

关键词：水银花；灰毡毛忍冬皂苷乙；川续断皂苷乙；含量测定；高效液相色谱法

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）04-0054-04

水银花是忍冬科植物毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehder的干燥花蕾或带初开的花。广西壮族民间习将其作为金银花使用，具有清热解毒、疏散风热的作用，用于风热感冒、咽喉肿痛、痢疾、疮疡肿毒、丹毒[1]。2010年版《中华人民共和国药典》（一部）“山银花”来源为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、华南忍冬Lonicera confusa DC.或黄褐毛忍冬Lonicera fulvotnetosa Hsu et S.C.Cheng.的干燥花蕾或带初开的花，“金银花”来源为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花[2]，水银花则未收入。文献记载，忍冬属植物部分种含有灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙，如从毛花柱忍冬和灰毡毛忍冬花蕾中分离得到灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙等[3-4]，从华南忍冬中分离出灰毡毛忍冬皂苷乙[5]。为正确评价和控制水银花药材质量，本研究以灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的总量作为指标，建立高效液相色谱法（HPLC）测定水银花含量的方法。现报道如下。

1 仪器与试药

日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，带自动进样器， ELSD-LT Ⅱ蒸发光散射检测器，LC solution色谱工作站；Waters2695高效液相色谱仪，带自动进样器，Alltech ELSD 2000ES蒸发光散射检测器，Empower工作站；SB3200DTS双频超声清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；XS205电子天平（瑞士梅特勒公司）；摩尔分子超纯水器（美国热电公司）。

水银花药材3批（1号，广西药用植物园，采集时间2011年4月；2号，马山县加方乡加让村拉林屯，采集时间2010年10月；3号，隆安县城厢镇良安村那料屯，采集时间2011年5月），其中1、2号样品的对号腊叶标本经广西中医药研究院方鼎研究员、广西食品药品检验所黄燮才主任中药师鉴定，均为忍冬科植物毛花柱忍冬Lonicera dasystyla Rehder。灰毡毛忍冬皂苷乙对照品（含量99.8%，批号20152-201003）、川续断皂苷乙对照品（含量98.3%，批号20153- 201003）均购自南昌贝塔生物科技有限公司。流动相所用甲醇和乙腈均为色谱纯（美国Fisher公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 色谱柱的选择 在同一色谱条件下，分别对Diamonsil C18柱、KF C18柱、Agilent ZoRbAx SB-Aq C18柱（均为250 mm×4.6 mm，5 ?m）进行摸索。结果上述3根色谱柱均可得到良好的分离效果，故选Diamonsil C18柱作为色谱柱。

2.1.2 流动相的选择 在同一色谱条件下，分别对甲醇-水溶液（55∶45）、乙腈-0.4%醋酸（27∶73）等度洗脱、乙腈（A）-0.4%醋酸（B）梯度洗脱（0～10 min，88.5%85%B；10～12 min，85%71%B；12～18 min，71%67%B；18～30 min，67%55%B）等流动相进行摸索。结果乙腈（A）-0.4%醋酸（B）梯度洗脱的流动相系统较甲醇-水溶液（55∶45）和乙腈-0.4%醋酸（27∶73）分离效果好，故选择乙腈（A）-0.4%醋酸（B）梯度洗脱。流速分别考察了0.8、1.0、1.2 mL/min不同流速，结果3种流速洗脱，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙峰均可得到良好的分离效果，故选择流速为1.0 mL/min。

2.2 提取溶剂及方法

分别取6份水银花粉末0.4 g。其中2份分别精密加入50%甲醇和80%乙醇50 mL，超声提取（功率250 W，频率40 kHz，下同）40 min；另2份分别精密加入50%甲醇和80%乙醇50 mL，冷浸15 h；最后2份分别精密加入50%甲醇和80%乙醇50 mL，回流提取1 h。放至室温，再称定质量，用相应溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，用微孔滤膜过滤，进样测定。结果以50%甲醇和80%乙醇作为提取溶剂，均以超声提取得率较高，且3种方法提取比较，均以50%甲醇作为溶剂超声提取得率最高。故初步确定采用50%甲醇超声提取的方法制备供试品溶液。见表1。

2.3 提取条件的优化

2.3.1 正交试验设计 选择药材破碎度（A）、药材称样量（B）、甲醇浓度（C）和提取时间（D）作为考察因素，因素水平见表2。选用L9（34）正交表进行试验，以灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总含量（Y）作为考核指标，优化供试品溶液的制备条件。正交试验结果及方差分析见表3、表4。

2.3.2 结果分析及供试品溶液制备条件的优化 由表3可知，各因素对灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙得率的影响程度为：C（甲醇浓度）>A（药材破碎度>D（提取时间）>B（药材称样量），各因素的不同水平对供试品溶液灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总量有显著影响。根据试验结果，最佳提取条件为A3B1C2D2，因C1与C2差异不大，并参考2010年版《中华人民共和国药典》（一部）“山银花”含量测定项下提取溶剂，确定提取条件为A3B1C1D2，即药材粉碎为过四号筛的粉末，称取药材粉末0.4 g，加入50%甲醇50 mL，超声处理40 min。

2.4 溶液制备

2.4.1 对照品溶液的制备 取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品、川续断皂苷乙对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含灰毡毛忍冬皂苷乙0.6 mg、川续断皂苷乙0.2 mg的混合溶液，即得。

2.4.2 供试品溶液的制备 取水银花药材粉末（过四号筛）约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀、滤过，取续滤液，即得。

2.4.3 阴性对照溶液的制备 取50%甲醇作为阴性对照溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 精密吸取上述3种溶液各10 ?L进样，

测定。结果供试品溶液的色谱图中均有与灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙保留时间相同的吸收峰，阴性对照品溶液的色谱图则无此吸收峰。说明本法测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙含量专属性强，无阴性干扰。见图1。

2.5.2 线性关系及范围 分别精密吸取灰毡毛忍冬皂苷对照品溶液（398 ?g/mL）0.1、2.5、5、7.5、10 mL，各加50%甲醇定容至10 mL。分别精密进样10 ?L，以对照品的进样量（?g）为横坐标，峰面积积分值的对数为纵坐标，绘制标准曲线。结果当灰毡毛忍冬皂苷乙对照品进样量在0.039 8～3.980 ?g范围时，进样量与峰面积呈良好线性关系，灰毡毛忍冬皂苷乙回归方程为Y=1.147 7X+5.321，r=0.993 0。

分别精密吸取川续断皂苷乙（212 ?g/mL）对照品溶液0.1、2.5、5、7.5、10 mL，各加50%甲醇定容至10 mL。分别精密进样10 ?L，以对照品的进样量（?g）为横坐标，峰面积积分值的对数为纵坐标，绘制标准曲线。结果川续断皂苷乙对照品进样量在0.021 2～2.12 ?g范围内与峰面积呈良好线性关系，川续断皂苷乙回归方程为Y=1.091 1X+5.191 9，r=0.996 1。

2.5.3 精密度试验 取同一份供试品溶液（1号），按上述色谱条件，连续测定5次。结果灰毡毛忍冬皂苷乙平均含量为5.55%，RSD=2.95%（n=5）；川续断皂苷乙平均含量为1.69%， RSD=2.42%（n=5）。表明本法的精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批供试品（1号）粉末约0.4 g，精密称定，按上述方法平行测定6份，计算。测得灰毡毛忍冬皂苷乙含量平均值为5.59%，RSD=2.05%（n=6）；川续断皂苷乙含量平均值为1.72%，RSD=2.31%（n=6）。表明本法的重复性较好。

2.5.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（1号），分别于0、2、4、6、8、24 h各进样测定1次。结果灰毡毛忍冬皂苷乙含量的RSD=2.68%，川续断皂苷乙含量的RSD=2.46%。

2.5.6 加样回收率试验 分别精密称取已知含量的样品粉末（干燥品）0.2 g共6份，精密称定，各加入灰毡毛忍冬皂苷乙（0.19 mg/mL）和川续断皂苷乙（0.056 8 mg/mL）混合对照品溶液50 mL，同法制备供试品溶液，并测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙含量，计算平均回收率及相对标准偏差。结果灰毡毛忍冬皂苷乙含量平均回收率为97.87%，RSD=2.70%（n=6）；川续断皂苷乙含量平均回收率为95.03%，RSD=2.63%（n=6）。见表5、表6。

2.5.7 仪器最低检出限试验 分别取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品和川续断皂苷乙对照品甲醇溶液进行稀释，计算信噪比3∶1时注入仪器的量。结果灰毡毛忍冬皂苷乙的最低检出限约为0.027 9 ?g，川续断皂苷乙的最低检出限约为0.021 2 ?g。

2.5.8 耐用性试验 分别采用不同品牌的色谱柱（Diamonsil C18柱、KF C18柱、Agilent ZoRbAx SB-Aq C18柱，规格均为5 ?m， 4.6 mm×250 mm），测定样品（1号）中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的总量，3根色谱柱测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总量平均值为7.61%，RSD=1.91%（n=3）；分别采用不同品牌的色谱仪（Waters2695、岛津LC-20AT）测定样品（1号）中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总量。两台色谱仪测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总量平均值为7.46%，RAD=0 （n=2）。结果表明，不同品牌色谱柱和不同品牌高效液相色谱仪对本法测定结果影响不大。

2.6 样品含量测定

分别取上述样品，以上述确定的试验条件制备供试液，并进行灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总量测定（n=2）。结果1号样品含量为7.45%，2号样品含量为1.00%，3号样品含量为1.01%。

3 讨论

水银花为广西常用的壮药材，该药材在广西分布较广，部分地区有大量种植，且使用历史悠久。长期以来，该药材一直处于无标准的状态中，由于无含量测定的方法，该药材一直缺乏质量的评价，更无质量优劣的标准控制，严重影响了临床用药的安全和疗效。文献记载，忍冬属植物部分种含有灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙[3-5]。2010年版《中华人民共和国药典》（一部）“山银花”的含量测定项下收载了灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的含量测定[2]，本研究参考药典“山银花”含量测定的指标，以灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的总量作为测定成分，建立了水银花药材中的灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙总量的HPLC测定方法。

本研究对供试品溶液制备在药材破碎度、药材称样量、甲醇浓度和提取时间等方面进行了正交试验，优化了制备条件；对HPLC色谱柱和流动相进行了摸索，确定了色谱条件；建立的含量测定方法经方法学考察，表明本方法精密度、重复性、准确度和耐用性均良好，专属性强，各项主要技术指标均符合中草药含量测定的技术要求，可作为水银花药材质量评价和控制的方法。本研究建立的含量测定方法现已收入《广西壮族自治区壮药质量标准》（第二卷）水银花[含量测定]项中[1]，对于控制水银花药材质量具有积极意义。

参考文献：

[1] 广西壮族自治区食品药品监督管理局.广西壮族自治区壮药质量标准：第二卷[S].南宁：广西科学技术出版社，2011：71-72.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药出版社，2010：28-29，205-206.

[3] 罗咏晴，李会军，李萍，等.毛花柱忍冬花蕾化学成分研究[J].林产化学与工业，2010，30（1）：73-76.

[4] 陈君，许小方，柴兴云，等.灰毡毛忍冬花蕾的化学成分[J].中国天然药物，2006，4（5）：347-351.

[5] 刘丹，夏琳琳.山银花化学成分研究[J].黑龙江科技信息，2007（12）：298.

（收稿日期：2012-12-03，编辑：陈静）