放疗对食管癌患者血清可溶性MICA含量及外周血NK细胞功能的影响

【摘要】 目的 探讨经不同剂量高能X线照射后食管癌患者血清可溶性MHC-I类分子链相关基因A (sMICA)含量、自然杀伤细胞(NK细胞)表面NK细胞2族成员D(NKG2D)受体的表达及其杀伤毒性的变化。方法 采用ELISA法检测中晚期食管癌患者(n=28)和正常对照(n=21)血清sMICA的含量,并动态分析6例食管癌患者经不同剂量高能X线照射后血清sMICA含量的变化。采用流式细胞术检测NK细胞NKG2D受体的表达,胞内染色法分析NK细胞杀伤靶细胞功能的变化。结果 与正常对照相比,食管癌患者血清sMICA含量明显升高,但不同放疗剂量对食管癌患者血清sMICA含量无显着影响。食管癌患者外周血阳性表达NKG2D的NK细胞比例与正常对照相比显着降低,同时其细胞毒活性亦明显降低。而且与治疗前相比,40~60 Gy的放疗剂量时NKG2D阳性的NK细胞数增加,同时其NK细胞毒活性最强。结论 放疗对食管癌患者血清sMICA含量无明显影响,但适量放疗可使NK细胞毒活性增强。

【关键词】 食管肿瘤;放射治疗;MHC-I类分子链相关基因A; 自然杀伤细胞

MHC-I类分子链相关基因A(MHC class I chain-related gene A, MICA)位于HLA-B位点上游约46 kb,其编码分子结构类似HLA-I类分子,但不与β2微球蛋白结合,不递呈抗原肽。MICA主要表达于绝大多数肿瘤细胞、病毒感染的细胞、受诱导分化药物处理的细胞及射线照射引起DNA损伤的细胞,代表着机体的一种应激反应[1]。MICA通过与NK细胞、CD8+ T细胞表面的活化性受体NK细胞2族成员D(NKG2D)相结合,激活免疫系统而清除肿瘤及其他基因组损伤的细胞,在抗肿瘤和抗感染中发挥重要作用[2]。然而研究发现,肿瘤细胞表面的MICA分子可受到金属蛋白酶的降解而成为可溶性分子(sMICA),sMICA与NKG2D结合后促进了受体的内吞和降解,进而抑制NK细胞的功能[3]。在前列腺癌[4]、肠癌[5]、宫颈癌[6]及头颈癌[7]中均显示血清内sMICA含量与患者预后呈负相关。另外,我们的前期研究发现,放疗可促进食管癌细胞株ECA-109表达MICA分子[8],但其是否对食管癌患者血清sMICA的含量产生影响,目前尚不清楚。

研究发现,NKG2D是NK细胞表面重要的活化性受体,其表达量高低可反映NK细胞的活性状态[9]。在食管癌的放疗过程中,放疗剂量决定其局部肿瘤控制率,但过高剂量的照射往往损伤患者的免疫功能。因此本研究探讨食管癌患者在接受放疗时对血清sMICA含量、NKG2D阳性表达的NK细胞比例及NK细胞毒功能的影响,从而深入了解食管癌患者放疗过程中患者体内NK细胞功能的变化,为进一步研究放疗联合免疫增强治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂和药品 ELISA双抗体夹心法检测试剂盒,购自德国Immatics Biotechnologies公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG,购自深圳晶美公司。淋巴细胞分离液购自上海生物工程公司;小牛血清和胎牛血清为杭州四季青公司产品; RPMI-1640培养基为Invitrogen公司产品;青霉素、链霉素、β巯基乙醇为上海生物工程公司产品;K562细胞为本室常规保存;FITC-CD56单克隆抗体(mAb)、PE-Cy5-穿孔素mAb、PE-NKG2D mAb购自eBioscience公司。

1.2 分组 正常对照组:21例正常人,男12例,女9例,年龄18~62岁。收集血清5 ml,其中11例同时收集外周抗凝血5 ml。食管癌组:28例中晚期食管癌患者 (均为食管病灶长度>5 cm,未发现其他的转移灶),男16例,女12例,年龄51~78岁。

1.3 方法

1.3.1 直线加速器照射食管癌患者 所有食管癌患者予以瓦利安直线加速器6 MV X线进行放疗。放疗后收集血清5 ml,中25例同时收集外周抗凝血5 ml。另外,6例食管癌患者在治疗前、治疗剂量累计达20~30 Gy及40~60 Gy时均收集血清5 ml、外周抗凝血5 ml。

1.3.2 ELISA法检测血清sMICA浓度 双抗体夹心法,包被抗体为AMO1,检测抗体为BAMO3(针对MICA分子的α3结构域),酶标抗体为HRP标记的羊抗鼠抗体。取标准品、患者血清、正常对照组血清及PBS各100 μl加入各孔。封盖后37℃孵育2 h;冲洗3次,用试剂稀释液将检测抗体稀释成终浓度为400 μg/L,各孔加入100 μl,封盖37℃孵育2 h;冲洗3次,加酶,冲洗3次,加底物,当显色满意后每孔加入终止液(1 mol/L硫酸)50 μl终止反应;轻拍使之混匀后立即上机检测,以450 nm读取光密度值。经标准品曲线拟合后获得每份标本中sMICA的含量。

1.3.3 流式细胞仪检测NKG2D的表达 取5 ml外周抗凝血,Ficoll常规分离外周血单个核细胞(PBMC),分别用PE-NKG2D单抗、PE-Cy5-CD56单抗,FACS Aria流式细胞仪检测NKG2D阳性表达的NK细胞比例。

1.3.4 NK细胞毒活性测定 当NK细胞杀伤靶细胞时,释放其细胞内的穿孔素,胞内染色法分析穿孔素阳性NK细胞减少的数量(即释放穿孔素的NK细胞)占总NK细胞的比例,可代表NK细胞的杀伤毒性。具体方法为:取外周抗凝血5 ml,Ficoll常规分离PBMC,与对数期K562细胞按10∶1比例37℃ 5% CO2孵育2 h,加入高尔基体阻断剂brefield A(BFA, 10 mg/L),4 h后按照eBioscience公司胞内染色法的操作说明标记NK细胞内的穿孔素。

1.4 统计学处理 用Graphpad 4.0软件进行数据处理。组间血清sMICA含量、NKG2D阳性表达的NK细胞数、NK细胞毒活性的比较均用团体t检验。食管癌患者不同剂量照射后血清sMICA含量的变化用ANOVA方差分析和q检验。食管癌患者经不同剂量照射后NKG2D表达率、NK细胞功能的变化采用团体t检验。P<0.05认为差异有显着性。

2 结 果

2.1 食管癌患者血清sMICA含量的变化 与正常对照组相比,食管癌组血清内sMICA含量显着升高(P<0.05)。见表1。 表1 2组血清sMICA含量的比

2.2 不同剂量放疗后食管癌患者血清sMICA含量的变化 我们动态观察了6例患者在治疗前、治疗剂量分别累计到20~30 Gy和40~60 Gy时血清sMICA含量的变化。结果显示,6例患者于治疗前、20~30 Gy及40~60 Gy的治疗剂量时血清内sMICA含量无明显变化(P>0.05)。见表2。表2 不同放疗剂量对食管癌患者血清sMICA含量的影响

2.3 食管癌患者外周血NK细胞NKG2D阳性表达率及NK细胞毒功能的变化 利用流式细胞术分析食管癌组和正常对照组外周血NK细胞表达NKG2D的阳性率,结果显示食管癌组NKG2D阳性率显着降低(P<0.05),见表3。同时利用胞内染色法分析NK细胞接触K562细胞时,释放穿孔素的NK细胞比例作为评价NK细胞杀伤毒性,比较2组NK细胞的杀伤毒性,发现食管癌组NK细胞毒性明显降低(P<0.05),见表4。表3 2组NK细胞NKG2D阳性表达率的比表4 2组NK细胞杀伤毒性的比较

2.4 40~60 Gy的放疗剂量时NKG2D阳性表达率及NK细胞毒功能的变化 对6例食管癌患者动态检测其体内NKG2D的表达率及NK细胞毒功能,分别比较治疗前、20~30 Gy和40~60 Gy的治疗剂量时NKG2D阳性表达的N K细胞数,发现40~60 Gy的治疗剂量时NKG2D表达率最高,与治疗前相比差异有显着性(P<0.05),见图1。与之对应的是,此时NK细胞杀伤毒性亦最高,与治疗前相比明显提高(P<0.05),见图2。

3 讨 论

我们采用回顾性研究的手段,不仅分析中晚期食管癌患者与正常个体血清内sMICA含量、NKG2D阳性表达的NK细胞数及NK细胞毒活性,还观察了接受不同放疗剂量治疗后,患者血清内sMICA含量的变化、NKG2D的表达及NK细胞功能变化,从而在整体水平研究高能X线照射对患者体内肿瘤抗原表达及免疫功能的影响,为在放射治疗过程中及时监测患者体内肿瘤负荷及评估免疫功能提供理论依据。

前期研究表明,sMICA下调NK细胞的功能,而且随着多数肿瘤病程的进展,sMICA在血清中的含量升高。Groh等[3]发现sMICA能诱导T细胞表面NKG2D的内吞和降解,并发现在胃肠恶性肿瘤患者的血清中含高水平的sMICA分子,且浸润至肿瘤部位的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)和外周血T淋巴细胞表面NKG2D受体的表达明显低下,从而认为是这些从肿瘤细胞表面释放的sMICA分子导致了NKG2D的下调,并进一步严重影响了抗原特异性T细胞的活性[10]。Salih等[11]证实白血病患者的瘤细胞亦表达NKG2D受体的配体MHC-I类分子链相关基因(MIC)和UL 16结合蛋白(ULBP),且患者血清中亦含有高水平的sMICA分子。Doubrovina等[5]发现结肠癌患者血清中的高水平sMICA还可引起细胞毒性受体NKp44的表达下调,影响NK细胞的细胞毒功能。Jinushi等[12]发现,晚期肝癌患者血清中sMICA含量明显高于早期患者。本研究结果显示,食管癌患者与正常人相比,血清sMICA含量明显升高,说明sMICA同样与食管癌的进程相关。但不同剂量放疗后食管癌患者血清sMICA的含量无明显变化,提示放疗虽然可以促进肿瘤细胞上调膜表面MICA抗原表达,却对MICA自肿瘤细胞表面脱落无重要影响。

MICA与NKG2D在抗肿瘤免疫中占有重要地位。NKG2D在结肠癌患者的NK细胞/T细胞上的表达降低已得到证实[13]。本研究结果显示,与正常人相比食管癌患者外周血NK细胞NKG2D表达降低,同时外周血NK细胞毒活性降低,提示食管癌可通过下调NK细胞功能而逃逸免疫系统的监视。40~60 Gy的放疗剂量时NK细胞表面NKG2D表达显着上调,NK细胞毒活性最强,提示放疗剂量不是越高越好,过高的剂量不但损伤周围正常的组织,而且损伤了患者的免疫功能,结果虽然提高了肿瘤的局部控制率,反而降低了患者的远期生存率。

另一方面,40~60 Gy的放疗剂量引起NKG2D阳性的NK细胞数增加及NK细胞毒功能增强的原因并不清楚,可能与放疗杀死肿瘤组织、降低肿瘤负荷有关。而sMICA在放疗后无明显变化可能与本研究收集样本相对较少有关,扩大样本量可带来更明确的结果。同时,本研究亦提示自肿瘤细胞脱落的sMICA仅是下调NK细胞功能的原因之一,而肿瘤细胞分泌的转化生长因子-β(TGF-β)和IL-10可能是抑制免疫功能的更重要因素[14]。总之,在肿瘤的临床治疗中,当我们为了提高肿瘤的局部控制率不得不予以高剂量的放疗时,可与免疫增强疗法联用,不仅可提高肿瘤的局部控制率,还可延长患者的远期生存率