虫草多糖的分离纯化及含量测定
时间：2022-08-19 06:35:51
【前言】虫草多糖的分离纯化及含量测定由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。培养箱(常州市恒久仪器制造有限公司光照培养箱);高压蒸汽灭菌设备(鸡西辰丰医疗器械制造有限公司YXQ.L-75型立式压力蒸汽灭菌器);大容量离心机(北京时代北利离心机有限公司GTR10-2);紫外分光光度计(上海悦丰仪器仪表有限公司)等。 1.3?培养基配方 1.3.1?活化培养基(g/m...
冬虫夏草首载于本草从新,味甘,性温,归肺、肾经,具补肺益肾,止血化痰之功效。冬虫虫草中含量最高的活性物质是虫草多糖,因其可以抗氧化、抗肿瘤和增强免疫力等功效而受广大人群青睐,由于天然的活性成分来源有限,现多采用人工发酵法生产制备。作者用苯酚-硫酸法测定虫草多糖含量。
1?材料
1.1?供试材料
虫草菌株(青海省);蒸馏水(双蒸水)、发酵液精多糖Ⅰ和菌丝体精多糖Ⅱ;葡萄糖标准溶液(100 μg/mL)等。
1.2?仪器及设备
培养箱(常州市恒久仪器制造有限公司光照培养箱);高压蒸汽灭菌设备(鸡西辰丰医疗器械制造有限公司YXQ.L-75型立式压力蒸汽灭菌器);大容量离心机(北京时代北利离心机有限公司GTR10-2);紫外分光光度计(上海悦丰仪器仪表有限公司)等。
1.3?培养基配方
1.3.1?活化培养基(g/mL)?蔗糖溶液1.30%,葡萄糖溶液1.30%,蛋白胨0.01%,酵母粉0.065%,琼脂0.5%,KH2PO4 0.025%,MgSO4·7H2O 0.012 5%,pH自然,培养温度27℃。
1.3.2?发酵培养基(g/mL)?葡萄糖1.75%,蛋白胨0.02%,酵母粉0.062 5%, KH2PO4 0.025%,MgSO4·7H2O 0.012 5%, pH自然,温度27℃[1]。
2?方法
2.1?配制培养基和灭菌
按体积向培养基中加入蒸馏水,加热煮沸,调节pH值至中性,趁热倒入容器中。高压蒸汽灭菌,温度121.9℃,时间20 min。灭菌完成,趁热倒在平板上。
2.2?活化菌种
在无菌条件下,将冷冻完好的菌种接到培养基上,无光条件下27℃培养,培养菌丝洁白并生长旺盛且无杂菌后备用。
2.3?配制发酵培养基及培养
把培养基上的菌种快速接入到发酵培养基中,在27℃条件下,无光培养192 h。
2.4.1?发酵液及透析袋的处理?发酵液在4 000 r/min条件下离心20 min,过滤得到上清液和沉淀(菌丝体)。将透析袋分成小段后,处理后在4℃条件下存放于冰箱保存待用。
2.4.2?发酵液多糖的提取?醇沉:将无水乙醇以3倍体积加于发酵液中,离心后得上清液,4℃条件静置12 h后,在4 000 r/min离心15 min,过滤得沉淀,用乙醇洗涤。脱蛋白:用热水将发酵液粗多糖溶解,冷却后反复3次去蛋白。脱色:多糖溶液加1.5%活性碳去色素,透析:将脱色后的虫草多糖溶液装入透析袋中,在蒸馏水中透析24 h,将3倍体积乙醇加于透析后溶液中,在4℃条件下沉淀过夜,离心得沉淀物并干燥,制得发酵液精多糖[3]。
2.4.3?沉淀物的处理?用研钵研碎发酵所制得的菌丝体,加蒸馏水至体积的10倍,水浴加热96~100℃条件下浸提3 h,反复浸提3次并将滤液合并,加入95%乙醇至4倍体积并低温沉淀过夜,离心制得沉淀,然后用乙醇和丙酮各洗涤2次,干燥,得粗多糖。
2.5?发酵液多糖的测定[4]
2.5.1?制作葡萄糖标准曲线?将葡萄糖标准溶液(100 μg/mL) 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL加入试管中,加蒸馏水至10.0 mL。用移液管分别移取2.0 mL加入比色管中。滴入重蒸苯酚溶液1.0 mL,震动摇晃均匀,立即加入浓硫酸5.0 mL摇匀,静置10 min,水浴加热30 min,温度40℃。
在波长490 nm处,测定每个管的吸光度,得A值(以2.0 mL蒸馏水作为空白)。横坐标为蔗糖浓度,纵坐标为吸光度A做标准曲线,制得回归方程:y=0.004 3x+0.029 9。
2.5.2?测定样品含量?将干燥至恒重的发酵液精多糖50 mg,用减量法称取后放置在100 mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,作标号Ⅰ。取样品液Ⅰ 1.0 mL,按刚制得的标准曲线方法,测定多糖溶液A值,平行测定3次。计算得出含量[5]。
3?结果
3.1?虫草多糖含量测定
冬虫夏草的产地不同,提取率也不同,其有效成分多糖的含量用苯酚一硫酸法测定结果也不同,测定结果见表1。
3.2?与蒽酮一硫酸法比较
取北虫草子实体,用蒽酮一硫酸法进行测定,得到4个样品的多糖含量数值分别为3.29%、3.50%、3.39%、3.30%,但是这种测定方法对于测定虫草发酵液的胞外多糖重现性不好,对测定结果的少部分蛋白影响较大。
4?讨论
4.1?浓硫酸对测定结果的影响
必须快速滴加浓硫酸,这样才能使高温瞬时产生,有利于多糖完全水解,如果滴加硫酸过慢,则不能产生高温条件,则多糖水解不完全,会给测定结果造成误差[6]。
4.2?苯酚对测定结果的影响
苯酚应配制成一定浓度的溶液,并且在整个检测过程中滴加苯酚动作要迅速,避免苯酚氧化变性,对测定结果产生影响。
现在虫草多糖的检测方法中,主要测定是粗多糖含量。用苯酚一硫酸法测定时,不需要虫草多糖的纯品和高级精密仪器,优点是灵敏度高、准确性高、精确度高、重现性好、简单快速等优点,可以作为对虫草多糖含量测定的最佳选择方法之一。
[参考文献]
[1] 袁建国,程显好,侯永勤,等.功能因子冬虫夏草多糖的研究开发[J].中国食品添加剂,1999(2):18-22.
[2] 韩永萍,林强,何绪文.虫草菌丝体多糖的提取研究[J].中国食用菌,2007(6):53-55.
[3] 来永斌,王琦,孙月.蛹虫草多糖含量的测定及分析[J].中成药,2001,23(7):517-518.
[4] 闫文娟,李泰辉,唐芳永.广东虫草多糖的提取及含量测定[J].华南农业大学学报,2004(30):53-56.
[5] 鲁晓岩.硫酸-苯酚法测定北冬虫夏草多糖含量[J].食品工业科技,2002,23(4):69-70.
[6] 王祖华,张柯,李永程.冬虫夏草菌种的制备及液体培养基的优化[J].洛阳理工学院学报,2010,20(4):10-12.
