吸入氢气对脓毒血症大鼠急性肺损伤的影响

[摘要] 目的 探讨吸入氢气（H2）对脓毒血症大鼠急性肺损伤的影响。 方法 选取雄性SD大鼠40只，体重200～250 g。采用随机数字表法将其分为4组（n = 10）：假手术组（SH组）、盲肠结扎穿孔组（CLP组）、1% H2组和2% H2组。采用CLP法制备脓毒血症模型。1% H2组与2% H2组于CLP术后12 h分别吸入1% H2与2% H2 2 h。结束后，采集股动脉血样行血气分析，计算氧合指数（PaO2/FiO2）；测定血浆中高迁移率族蛋白1（HMGB1）、白细胞介素-6（IL-6）水平；随后处死大鼠取肺组织，检测肺组织中Toll样受体4（TLR-4）、核因子-кB（NF-κB）、髓过氧化物酶（MPO）活性；光镜下观察肺组织病理改变。 结果 与SH组比较，CLP组、1% H2组、2% H2组PaO2/FiO2降低，血浆中HMGB1、IL-6水平升高，肺组织TLR-4、NF-κB、MPO水平升高，病理学损伤明显加重（P < 0.05）。与CLP组比较，1% H2组、2% H2组PaO2/FiO2升高，血浆中HMGB1、IL-6水平降低，肺组织TLR-4、NF-κB、MPO水平降低，病理学损伤也减轻（P < 0.05），1% H2组和2% H2组上述各指标组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 吸入H2能够减轻脓毒血症引起的急性肺损伤，其机制可能与抑制炎性反应有关。

[关键词] 氢气；脓毒血症；大鼠；肺损伤

[中图分类号] R631 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（a）-0008-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of hydrogen （H2） inhalation on acute lung injury in rats with sepsis. Methods Forty healthy male SD rats （weighing 200-250 g） were randomly divided into 4 groups （n = 10） using a random number table： sham operation group （SH group）， cecal ligation and puncture group （CLP group）， 1% H2 group， 2% H2 group respectively. Sepsis model was produced by CLP. 1% H2 and 2% H2 group received 2 h inhalation of 1% H2 and 2% H2 at 12 h after CLP， respectively. At the end of hydrogen inhalation， blood samples were obtained for blood gas analysis. PaO2/FiO2 was calculated and the levels of high mobility group protein 1 （HMGB1）， interleukin-6 （IL-6） were determined. The rats were then sacrificed and lungs were immediately removed for determination of the activity of Toll-like receptors-4 （TLR-4）， nuclear factor kappa B （NF-κB） and myeloperoxidase （MPO）； pathology assessment of lung was done under light microscope. Results Compared with SH group， PaO2/FiO2 was significantly decreased， plasma levels of HMGB1， IL-6 increased， levels of TLR-4， NF-κB， MPO in lungs increased， and the pathological injury was significantly aggravated in CLP group， 1% H2 group and 2% H2 group （P < 0.05）. Compared with CLP group， PaO2/FiO2 increased significantly， levels of HMGB1， IL-6 in plasma decreased markedly， levels of TLR-4， NF-κB， MPO in lungs decreased， and the pathological injury was reduced in 1% H2 group and 2% H2 group （P < 0.05）. There were no significant differences of the above indexes between 1% H2 group and 2% H2 group （P > 0.05）. Conclusion Hydrogen inhalation can alleviate sepsis induced ALI in rats， and its mechanism may be related to inhibiting inflammatory response.

[Key words] Hydrogen； Sepsis； Rat； Lung injury

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种以急性肺部炎症及肺泡毛细血管屏障功能损伤为主要特征的危及生命的临床综合征。脓毒血症是引起ALI最主要原因之一[1-2]，目前尚没有有效的药物治疗措施。研究表明，氢气（H2）或含有H2的溶液具有选择性抗氧化、抗炎症等脏器保护作用[3-6]。本研究探讨吸入H2对大鼠脓毒血症肺损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性SD大鼠[购自常州卡文斯实验动物有限公司，批号为SCXK（苏）2011-0003]40只，SPF级，体重200～250 g，采用随机数字表法将其分为4组（n = 10）：假手术组（SH组）、盲肠结扎穿孔组（CLP组）、1% H2组和2% H2组。

1.2 动物模型制作

参照文献[7]的方法建立CLP模型，沿大鼠腹正中线做一长为1 cm的切口，游离肠系膜和盲肠，用4-0丝线环形结扎盲肠根部，用18号针头贯通穿刺盲肠结扎端，挤出少许粪便，后将盲肠还纳至腹腔，逐层缝合腹壁切口。SH组仅剖腹，分离盲肠远端，逐层关腹。

1.3 实验方法

参照文献[8]使用M177021H2发生器（北京中西远大公司）提供H2，其纯度为99.999%。将大鼠放入带有进气口和出气口的密封箱子内，将H2和空气混合后从进气口输入箱内，残余气体从出气口收集。用泵吸式JSA8-H2高敏氢气检测仪（深圳吉顺安科技有限公司）通过通气管路调定吸入H2浓度。1% H2组和2% H2组于CLP术后12 h时分别吸入1%的H2和2%的H2 2 h，SH组与CLP组只放置于箱子内，不吸入H2。

1.4 取材及处理方法

吸H2 2 h后，四组分别采集动脉血样3 mL，1 mL用于进行血气分析，采用i-STAT300型血气分析仪（Abbott公司，美国），计算氧合指数（PaO2/FiO2）；另外2 mL，于4℃ 3000 r/min离心15 min，取上清液，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血浆中高迁移率族蛋白1（HMGB1）、白细胞介素-6（IL-6）含量。随后处死大鼠，取左肺组织匀浆，4℃ 10 000 r/min离心15 min，离心后取上清液，采用ELISA测定肺组织中Toll样受体4（TLR-4）和核因子κB（NF-κB）含量（试剂盒购自于美国R&D公司）及髓过氧化物酶（MPO）活性（试剂盒购自南京建成科技有限公司）。严格按照说明书操作。取右肺组织，置于10%福尔马林中固定、石蜡包埋、切片、HE染色，在光镜下观察肺组织病理改变情况并参照文献[9]进行病理学损伤评分，1分：肺组织结构正常；2分：肺间质轻度充血和中性粒细胞浸润；3分：肺组织结构部分破坏，血管周围水肿形成，中度中性粒细胞浸润；4分：肺组织结构严重破坏，大量中性粒细胞浸润。随机选择10个非重叠视野进行评分，取其平均值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，采用LSD-t检验行两两比较，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠PaO2/FiO2及肺组织病理学评分比较

与SH组比较，CLP组、1% H2组、2% H2组PaO2/FiO2降低，病理学损伤明显加重（P < 0.05）。与CLP组比较，1% H2组、2% H2组PaO2/FiO2升高，病理学损伤明显减轻（P < 0.05）。1% H2组和2% H2组组间上述各指标比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 四组大鼠各项生化指标比较

与SH组比较，CLP组、1% H2组、2% H2组肺组织TLR-4、NF-κB、MPO活性明显升高，血浆中HMGB1、IL-6水平增高（P < 0.05）。与CLP组比较，1% H2组、2% H2组肺组织TLR-4、NF-κB、MPO活性降低，血浆中HMGB1、IL-6水平降低（P < 0.05），1% H2组和2% H2组组间上述各指标比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

ALI是感染、休克及创伤等多种原因引起的严重的肺部病理性改变，进一步可发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。据资料显示，ALI/ARDS是重症监护病房内患者死亡的主要原因之一[10]。目前只能采用支持治疗，尚无根治性治疗措施。目前的研究认为脓毒血症是导致ALI/ARDS的重要原因，而CLP是诱发脓毒血症的经典方法，已广泛用于实验研究[11-13]。本研究采用CLP制备大鼠脓毒症模型，术后10～12 h，大鼠开始出现活动减少、竖毛、蜷缩、呼吸急促等；同时，研究结果表明，炎症因子水平明显增高，提示脓毒血症模型制备成功；CLP后PaO2/FiO2降低，肺组织病理学损伤评分升高，提示脓毒血症诱发ALI的模型制备成功；而吸入H2后PaO2/FiO2升高，肺组织病理学损伤评分降低，提示吸入H2可以减轻大鼠脓毒血症诱发的ALI。

中性粒细胞浸润是引起ALI的重要原因之一[14-15]。肺组织中性粒细胞的浸润和激活在一定程度上决定了ALI的程度，大量中性粒细胞黏附聚集于肺组织毛细血管内，与血管内皮细胞相互作用，可导致肺损伤；中性粒细胞活化后透过呼吸暴发及脱颗粒作用，加重肺组织损伤[16]。MPO作为中性粒细胞的特异性酶，其活性可反映中性粒细胞的聚集浸润程度[17]。本研究结果提示，与CLP组比较，吸入H2组MPO活性降低，表明H2通过抑制组织中的MPO浸润从而减轻炎性反应。

TLR-4是诱导炎性反应的门户蛋白，研究提示它在多种病理反应中起重要作用[18-19]。CLP产生的内毒素刺激机体释放大量的HMGB1释放入血[20]，HMGB1作为TLR-4的内源性配体，可激活TLR-4信号通路，通过多种途径使NF-кB活化，从而导致炎症细胞因子IL-6的释放[21]。本研究结果表明CLP导致肺组织中的TLR-4、HMGB1、NF-кB的表达增加，血浆中的IL-6水平上升。吸入H2可以降低TLR-4、HMGB1、NF-кB及血浆中的IL-6水平。

H2无色无味，含量非常丰富。作为一种抗氧化物质，H2具有准备简单、无毒、无残留等优点，同时大量的研究表明H2能够改善各种因素导致的器官功能障碍[3-6]，因此H2治疗有着非常广泛的应用前景；当H2浓度大于4.6%时有爆燃的风险[8]，为安全起见，笔者只采用了低浓度的H2吸入作为治疗手段，这也是本研究的不足之处。

综上所述，吸入H2能够明显减轻脓毒血症引起的ALI，其机制可能与抑制炎性反应有关。

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（收稿日期：2015-04-25 本文编辑：张瑜杰）