PP2对人胆管癌细胞株的影响

1材料与方法

1.1实验材料

人胆管癌QBC939细胞株由医学院实验室提供；采用RPMI1640培养液、FCS胎牛血清、P-S双抗青霉素-链霉素美国（GIBCO公司）进行细胞培养，使用时按89:10:1比例配制成完全1640培养液做工作液；细胞培养板（美国Costar公司）；Src激酶特异性抑制剂PP2（Sigma公司，美国）；兔抗人磷酸化Src单克隆抗体（Tyr416，Millipore公司）；鼠抗人β-actin单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；Transwell侵袭小室（8pm孔径）（Millipore公司）；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）（碧云天生物技术研究所）；mRNA试剂盒(QIAGEN公司)；cDNA逆转录试剂盒(Thermo公司)；RT-PCR试剂盒(罗氏公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及实验分组人胆管癌QBC939细胞用含10％胎牛血清和P-S双抗的RPMI1640培养液，置于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱内进行培养；常规更换培养液，利用胰酶对细胞消化传代，实验采用处于对数生长期的细胞。实验共设四组，即空白对照组、实验A组、实验B组、实验C组（分别用2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L的Src激酶特异性抑制剂PP2处理）。

1.2.2PP2溶液配制Src激酶特异性抑制剂PP2溶解度为20mg/mL，利用DMSO作为溶剂，配制PP2饱和溶液。用含10％胎牛血清的培养液稀释获得50μmol/L的PP2母液进行备用，使用时根据需要再稀释获得不同浓度的工作液进行实验操作。

1.2.3WesternBlotting检测PP2对QBC939细胞Src激酶磷酸化的影响取对数生长期的QBC939细胞分别用2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L浓度的PP2处理48h后，以BCA法测定细胞裂解后获取的蛋白含量。取80μgSDS-PAGE，至PVDF膜，5％脱脂奶粉进行非特异性抗原封闭，加入1：500Tyr416，1：200的β-actin作为内参对照，4℃过夜，用含0.1％Tween20TBS洗膜，加入1：1000带有辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下反应1h，TBS洗膜后DAB显色并记录。

1.2.4人胆管癌QBC939细胞体外侵袭检测50mg/L基质胶按1：4稀释液包被8μm孔径Transwell小室滤膜的上表面，置于37℃5％CO2培养箱中温育1h，并用L-15水化小室滤膜上下表面。消化并收集细胞，离心去培养液。PBS洗2遍，用含0.1％BSA的L-15培养基重悬细胞，调整密度为1×105/mL细胞悬液。先在小室上层加入4组200μL细胞悬液，混匀后向下室加入600μL10％FBS的L-15培养液。将24孔板置于37℃无CO2培养箱中培养。48h后移出，置于4％多聚甲醛中固定30min，1％结晶紫染色10min，倒置显微镜观察，每组6个视野。实验重复三次。

1.2.5PCR检测mRNA表达取对数生长期的人胆管癌QBC939细胞经PP2处理48h，收集细胞，提RNA，逆转录为cDNA，取各组cDNA，用ddH2O稀释50倍。按要求加入试剂cDNA，正义引物，反义引物和ROX。设定循环：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃30s，95℃15s。

1.2.6WesternBlotting检测PP2对QBC939细胞侵袭相关分子蛋白表达的影响取对数生长期的人胆管癌QBC939细胞经PP2处理48小时后，收集细胞并对其进行裂解，提取细胞总蛋白，以BCA法测定细胞裂解蛋白含量。吸取定量后的80μg蛋白质，12%SDS-PAGE法进行分离后，转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭非特异性抗原，分别加入稀释后的鼠抗人E-cad-herin和CD44一抗，鼠抗人β-actin单克隆抗体进行1：200稀释作为内参对照，4℃反应过夜后，用含0.1％Tween20的TBS洗膜，加入二抗，室温下反应1h，DAB显色并记录结果。

1.3统计学方法

研究数据汇总后采用SPSSl7.0统计软件进行统计分析，收集数据以mean±SD表示，数据经过正态性检验资料，多组间整体比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法及HSD法，显著性水准均取α=0.05。

2结果

实验组p-Src蛋白表达水平明显低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。实验组穿过小室的细胞数显著低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。经PP2处理后，实验组E-cadherinmRNA表达显著增强，而CD44mRNA表达显著降低，差异具有统计学意义（P<0.005）。实验组E-cadherin蛋白水平明显增高，而CD44蛋白水平则显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

肿瘤细胞侵袭是一个复杂的过程，随着细胞间粘附性降低，肿瘤细胞脱离其原发部位，散落至其他部位，形成转移灶[12]。研究显示，Src激酶在肺癌、宫颈癌等多种实体恶性肿瘤组织中被活化而过表达，活化后的Src激酶对其下游信号转导分子进行磷酸化，进而影响肿瘤细胞的侵袭能力[13]。PP2是一种pyrazolopyrimidine复合物，能够选择性抑制Src激酶家族，是Src激酶的特异性抑制剂[14]。本研究通过PP2抑制人胆管癌QBC939细胞中Src激酶，观察Src激酶抑制剂PP2对人胆管癌QBC939细胞侵袭能力的作用和机制。结果发现，人胆管癌QBC939细胞中Src激酶处于高活性状态，而用5μmol/L的Src激酶抑制剂PP2可显著抑制QBC939细胞中p-Src的表达（P<0.05）。此外，通过体外侵袭实验我们发现，Src激酶抑制剂PP2抑制QBC939细胞Src激酶的活化后，QBC939细胞的侵袭能力明显减弱（P<0.05）。结果表明，Src激酶抑制剂PP2能够抑制QBC939细胞中的Src激酶活性。这一结果与已有报道基本一致[15]。E-cadherin是广泛存在于组织的上皮细胞中的蛋白分子，对细胞的粘附聚集十分重要[16]。E-cadherin分子为肿瘤侵袭抑制分子，下调其表达后，肿瘤细胞的侵袭能力显著增强[17]。CD44分子则是与肿瘤预后密切相关的肿瘤促侵袭分子，当机体上调CD44的表达时，肿瘤细胞侵袭能力随即增强，肿瘤细胞更易进入血液及淋巴循环，导致肿瘤转移灶的产生[18]。本研究结果显示，Src激酶抑制剂PP2抑制Src激酶的活化后，E-cadherin分子mRNA水平和蛋白水平的表达显著增高（P<0.05），而CD44分子mRNA水平和蛋白水平的表达则明显降低（P<0.05）。结果证明，Src激酶抑制剂PP2抑制QBC939细胞中Src激酶的活化后，能上调肿瘤细胞侵袭抑制分子E-cadherin、下调肿瘤细胞促侵袭分子CD44mRNA水平，最终导致QBC939细胞侵袭能力减弱，而且5μmol/L抑制浓度为最佳。但是，PP2抑制Src激酶活化具体通过什么途径减弱肿瘤细胞的侵袭能力目前并不清楚，还需进一步研究证实。

综上所述，PP2能通过抑制Src激酶的活化显著抑制人胆管癌QBC939细胞的侵袭能力，机制可能是由于PP2抑制Src激酶活化后影响了肿瘤细胞侵袭抑制分子E-cadherin和促侵袭分子CD44的表达水平所致。这为胆管癌患者以Src激酶为治疗靶标的Src激酶特异性抑制剂抗肿瘤治疗策略的研发提供了实验依据。

作者：王大东 许勇 韩明明 窦春青 涂玉亮 朱自满 杨壮杰 金鑫 姜凯 杜楠 单位：总医院第一附属医院