苏云金杆菌Bt0601菌株发酵培养基的优化

摘　要：运用正交试验L18(33)设计对携带杀虫基因cry/Ac和虎纹捕鸟蛛毒素基因hwtx-I的苏云金杆菌工程菌Bt0601的发酵培养基进行了优化研究，试验获得的最佳优化复合培养基配方为(％)：玉米粉1.0，黄豆饼粉0.50，酵母膏0.15，蛋白胨0.05，磷酸二氢钾0.75，碳酸钙0.05，硫酸镁0.035，Bt0601在该优化培养基下发酵，48h每mL发酵液产芽孢11.4×109个，伴孢晶体23.0×107个，对3龄小菜蛾(Plutella xylostella)48h的致死率达96.7％，普通发酵培养基下相应的芽孢产量为9.33×109个，伴孢晶体9.57×107个，毒力为68，5％。

关键词：苏云金杆菌：工程菌；发酵培养基；正交设计

中图分类号：Q936　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0323-05

苏云金芽孢杆菌(简称Bt)发酵生产的杀虫剂因具有安全、高效的特性而广泛应用于农林害虫的防治。在Bt的发酵生产中，优良的发酵培养基是影响Bt发酵产物杀虫效果的关键因素之一，高浓度培养基中各种营养素的配比对Bt菌株的生长和晶体蛋白的产生至关重要，而且不同的Bt菌株因其遗传基础和表达蛋白种类的差异有不同的营养需求，为便于工业化生产，发酵培养基一般选择以生产成本较低廉的农副产品为主要碳氮源，申烨华等分别以玉米粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、鱼粉等为主要原料对工业上投入广泛使用的HD-1菌株的发酵培养基进行优化，获得了最佳碳氮比(CV/ )为2.0的优化培养基，王善利等以黄豆饼粉、可溶性淀粉、蛋白胨和无机盐对HD-1菌株的发酵培养基进行优化，同样获得了另一个优化发酵的培养基配方，本研究室的丁学知也对本室筛选的Bt4.0718菌株的发酵培养基和条件进行了系列优化，成功地为Bt4.0718菌株的工业化生产提供了依据。

随着Bt杀虫剂的广泛应用，其安全、环保、特异的优点越来越受到人们的青睐，但其弊端也日渐明显，如杀虫效果不如化学农药好，选择性强而不具有广谱性，害虫容易产生抗性，针对这些缺点，本研究室利用基因工程技术，将来源于虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)的Huwentoxin-I(简称HWTX-I)毒素基因与Bt杀虫基因crylAc融合，并克隆到苏云金杆菌无晶体突变株XBU001中，构建了一株高效杀虫工程菌Bt0601，HWTX-I是一种多肽类神经毒素，能阻断N-型乙酰胆碱和谷氨酸介导的神经一肌肉传导，从而麻痹害虫，将hwtx-I基因与crylAc基因融合，产生的融合蛋白CrylAc-HWTX-I既可发挥CrylAc毒素蛋白的高效杀虫性，又可发挥蜘蛛毒素HWTX-I的麻痹作用，从而导致害虫更快的死亡，并对抗CrylAc毒素的昆虫重新敏感，前期研究结果显示，Bt0601菌株对3龄小菜蛾的毒力比只携带crylAc基因的工程菌毒力高20.6％，考虑到工程菌大量表达的毒素基因的差异，其营养需求与野生型菌株可能也有较大差异，故本研究对工程菌Bt0601的最佳发酵培养基进行优化，以期获得毒力更高的产物，为Bt工程菌的发酵、Bt杀虫剂的工业化生产和应用提供一定的基础。

1　材料与方法

1．1　供试菌株

Bt0601工程菌株，无晶体突变株XBU001中转入携带crylAc、hwtx-I融合基因的pHT304载体，为湖南省微生物分子生物学重点实验室龙小山构建。

1．2　培养基

1．2．1　普通培养基：

牛肉膏1％，蛋白胨0.3％，KH2pO40.1％，pH 7.5；固体培养基再加2％的琼脂。

1．2．2 发酵培养基I：

蛋白胨1.0％，牛肉膏0.5％，葡萄糖0.3％，NaCl 0.2％，MgSO4・7H2O 0.03％，K2HPO4 0.03％，MnS04 0.005％，pH 7.2。

1．2．3　发酵培养基Ⅱ：

以玉米粉、黄豆粉为主要原料，辅以酵母粉、蛋白胨以及磷酸二氢钾、碳酸钙及硫酸镁，正交试验采用L18(37)设计(表1)，将优选出的培养基组合进行综合评比。

1．3　培养方法

将斜面活化的Bt0601菌株接种到5mL普通培养基中，30℃振荡培养8h后，以2％的接种量转接到30mL发酵培养基中，250r/min，30℃摇瓶振荡培养，至80％胞晶脱落停止培养。

1．4　测定方法

1．4．1 芽孢和晶体形态观察

用草酸胺结晶紫染色在油镜下观察芽孢和晶体的形态。

1．4．2 芽孢记数

采用血球计数板计数苏云金杆菌芽孢和伴孢晶体含量，结果采用DPS2000数据处理系统分析。

1．4．3 生物测定方法

采用浸叶饲喂法，测定Bt0601菌株发酵液对3龄小菜蛾的杀虫效果，即用取500μL菌液加入150mL无菌水配制好的Bt供试药液浸泡小白菜叶片，5min后取出，晾干后加入养虫瓶中，以无菌水浸泡的叶子为空白对照，接人10条大小一致、已饥饿24h的小菜蛾3龄幼虫，25℃恒温饲养，48h后统计致死率，试验重复3次。

1．4．4 发酵特性研究

以2％的接种量将活化的Bt0601菌株接人优化发酵培养基中，250r/min，30℃摇瓶振荡培养，每4h取样测定其在600nm的吸光值和pH值，研究该菌株在摇瓶发酵过程中的生长特性和pH变化情况。

2　结果

2．1　Bt0601工程菌发酵培养基优化设计

苏云金杆菌发酵产品质量考核主要以发酵液芽孢、晶体含量和杀虫效价为指标，但是实际生产中主要以发酵液中芽孢含量为考核标准，本研究对正交试验获得的发酵液孢子和伴孢晶体含量均进行了方差分析(表2～4)。结果显示，培养基中玉米粉、黄豆饼粉、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾、碳酸钙及硫酸镁的水平改变对提高芽孢和晶体含量均有影响；培养基中玉米粉与黄豆粉、黄豆粉与酵母粉的交互作用对提高芽孢含量也有影响(表2)；而玉米粉对伴孢晶体的形成影响最显著，从试验各因子不同水平对芽孢和晶体含量的影响(表2～4)可知：培养基中玉米粉的最佳选择是3水平1.0％；黄豆粉的最佳选择是1水平0.5％；酵母膏的最佳选择是3水平0.15％；蛋白胨的最佳选择是2水平0.05％；磷酸二氢钾的最佳选择是3水平0.75％；碳酸钙的最佳选择是1水平

0.05％；硫酸镁的最佳选择是2水平0.035％，因此，在实验室摇瓶发酵条件下苏云金杆菌Bt0601工程菌的最佳培养基配比为：A3B1C3D2E3F1G2，即玉米粉为1％，黄豆饼粉为0.5％，酵母膏为0.15％，蛋白胨为0.05％，磷酸二氢钾为0.75％，碳酸钙为0.05％。硫酸镁为0.035％，Bt0601在I-16发酵培养基中，30℃，振荡培养48h左右，每mL发酵液产芽孢达11.4×109个，伴孢晶体为23×107个。

本研究还比较了Bt0601菌株在以玉米粉、黄豆粉为主要原料的工业发酵培养基和实验室普通发酵培养基(I)中的发酵差异。研究发现，Bt0601菌株在普通发酵培养基，发酵周期稍短，44h左右孢晶脱落率达80％，每mL发酵液产芽孢9.33×109个，伴孢晶体9.57×107个，而在工业发酵培养基中48h孢晶脱落率才能达到80％，但每mL发酵液的芽孢产量和晶体产量却高于普通发酵培养基。

2．2 发酵培养基对Bt0601工程菌杀虫毒力的影响

不同发酵培养基下摇瓶发酵生产的Bt0601工程菌发酵液对3龄小菜蛾的杀虫效果如表5所示，不同组合配方的发酵培养基培养的Bt0601工程菌发酵液对3龄小菜蛾均有较高的毒力，且I一3，I-7，I-8，I-9，I-10，I-12，I-16，I-17，I-18发酵培养基发酵生产的Bt0601工程菌发酵液对小菜蛾48h的致死率均达90％以上，其中I-16的致死率最高，达96.7％，而对照发酵培养基中培养的发酵液对小菜蛾的致死率为68.5％，该结果与发酵液芽孢和晶体产量统计结果基本一致。

2．3　Bt0601工程菌的发酵特性

以2％的接种量将活化的Bt0601工程菌接人起始pH 7.5的优化发酵培养基中，30℃发酵培养，其生长曲线如图1，结果显示，0～12h为延滞期，12～28h为对数生长期，菌体浓度逐步增大，32h菌体浓度达到最大，28～44h菌体数变化不大，为稳定生长期，44～48h菌体浓度开始下降，进入衰退期，通过涂片观察，12h有少量菌丝体，24h有芽孢生成，32h有伴孢晶体生成，36h有菱形晶体出现。

2．4 XBU001工程菌株发酵过程中pH的变化

发酵过程中pH值的变化，是菌体在一定的环境条件下代谢活动的综合性指标，它集中反应了菌体的生长代谢和产物合成的情况，图1为Bt0601菌株在优化发酵培养基中发酵液pH值的变化曲线，发酵前期(0～12h)，pH值有所下降，这可能与延滞期酸性产物的积累有关，中期pH值上升，此时菌体从以碳素代谢为主的生长期逐渐转为以氮素代谢为主的产物合成期，NH+4的浓度变化非常活跃；后期随着代谢的减慢或者停止，NHNH+4浓度变化仍然很活跃，发酵液的pH值也继续上升，通过镜检发现，后期发酵液的菌体量明显下降，且有大量的菌体碎片存在，发酵后期发酵液pH值的上升可能是由于菌体死亡并伴随着菌体自溶造成的。

3　讨论

Bt0601菌株是携带两种不同毒素基因的工程菌，通过对其发酵培养基的优化，找到一种适合该菌株芽孢和晶体形成的优廉发酵培养基(％)：黄豆饼粉0.5，玉米粉1.0，酵母膏0.15，蛋白胨0.05，KH2PO4 0.75，CaCO3 0.05，MgSO4 0.035，pH 7.5，与普通发酵培养基相比，Bt0601在优化培养基中延滞期稍长，发酵周期也偏长，但芽孢和晶体产量分别提高22.2％和140.3％，毒力也相应提高28.2％，这可能与粗原料的利用速度较慢，但有利于芽孢晶体形成有关，我们的研究结果还发现，携带外源基因的工程菌Bt0601在同样的发酵条件下，发酵周期比野生型菌株Bt4.0718菌株要长，最早形成芽孢和晶体的时间要晚，这可能与外源基因在Bt菌株中被识别并进行表达调控有关，对Bt0601菌株最佳发酵培养基的确定，为实现Bt0601菌株的工业化发酵生产提供了一定的基础，本研究后续工作将对该菌株的发酵条件进行系列实验，并在30L发酵罐中进行验证。

作者简介：陈宇(1972―)，女，贵州安顺人，讲师，硕士，主要从事微生物发酵研究。