定点突变技术研究苏云金杆菌CrY1类晶体蛋白结构与功能的进展

张春艳　胡胜标　单世平　夏立秋

摘要：近年来利用定点突变技术研究苏云金杆菌(Bacillus thuringiesis Bt)杀虫晶体蛋白(Insecticidal crvstalproteins，ICP)作用机制已取得良好进展，杀虫晶体蛋白不同结构域上氨基酸残基的突变将影响其稳定性，与受体的结合，不可逆的昆虫中肠膜插入及离子通道活性的强弱等，突变研究表明，结构域Ⅰ参与不可逆结合及插入昆虫中肠膜过程；结构域Ⅱ参与受体结合，包括初始结合与不可逆结合；结构域Ⅲ在杀虫特异性和维持三维结构的稳定性方面起重要作用，同时。可能参与离子通道的形成，受体结合和插入昆虫中肠膜过程，利用各种定点突变技术对各位点进行突变可以研究单一位点的功能，到目前为止，已有很多关于这方面的研究，并且筛选到了毒力提高的工程菌株。

关键词：苏云金杆菌：杀虫晶体蛋白：定点突变

中图分类号：Q933

文献标识码：A

文章编号：1007―7847(2007)02.0095―05

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis.Bt)是一种革兰氏阳性菌，Bt制剂被广泛应用于害虫防治，Bt在形成芽孢期间，能形成伴孢晶体，伴孢晶体在杀虫过程中起主要作用，它被昆虫吞食后，在中肠液碱性环境下被溶解，原毒素被肠液中蛋白酶降解成活性肽段，然后与中肠上皮细胞刷状缘膜(brush border membrane vesicles.BB-MV)受体结合，再插入中肠上皮细胞，形成离子通道，使渗透压失衡，导致昆虫死亡，在杀虫过程中，原毒素分子各结构域所起作用不同，为了探讨其作用机理，人们尝试利用各种技术如二步PCR法、寡核苷酸引物法及结构域的杂交等方法突变预期位点以研究其功能，目前应用最广泛的是定点突变法，定点突变(site-directed mutagen-esis)技术可以在已知DNA序列中任意取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。

1突变对Cryl类毒素的结构和功能的确定

1.1结构域Ⅰ的突变

结构域Ⅰ包括N端200多个氨基酸，大多具疏水特性，由8个反平行的螺旋扭成一束，a5位于中央，被其它螺旋所包围，结构域Ⅰ在中肠膜插入和孔道形成中发挥作用，毒素在细胞膜上形成孔道是先插入由疏水性的а5和两亲性的а4螺旋组成的发夹，Vincent Vachon等人曾报道CrylAa а3上突变E101C、E101Q、E101K、E116K、E116Q、E118C离子通道形成能力都大大降低，说明结构域Ⅰ上突变明显影响了离子通道的形成，在结构域Ⅰ上Cry1Aa R28V、R87A，Crv1Ac R93和Cry1Aa R99对毒力影响较大，且R99突变为其他氨基酸后失去了离子通道形成能力，CrylAaα4上带电氨基酸残基突变后，pH 7.5时，离子通道形成能力大大降低，T142D和T143D活性几乎完全丧失，R127E、R127N、R131H对蔗糖、棉子糖通透性大，而R131D和R13lH形成的孔道直径比野生型CrylAa要小，Nunez Valdez等人电压钳实验表明：A(不带电荷)92E(带负电荷)和Y(不带电荷)153D(带负电荷)离子通道形成能力降低，解离结合实验中这两个突变子与BBMV的不可逆结合明显降低，毒力也明显降低，而Y(、不带电荷)153A(不带电荷)和Y(不带电荷)153R(带正电荷)没有影响可逆结合和毒力，A(不带电荷)92D(带负电荷)对烟草天蛾(Manduca sexta)毒力大大降低，可能这个位点的突变能影响毒素从毒素受体复合物中解离的能力，92、153位只有引入带负电荷的氨基酸才会导致毒力的降低，所以带正电荷或者不带电荷的氨基酸是与带负电荷的中肠膜结合过程中必不可少的，α5和α7是高度保守的，Nunez Valdez等人还实验证明其在离子通道形成中起关键作用，α5上突变H168R毒力稍有提高，但K+通透性比野生型降低了24倍，R173L、R173N则降低了2～3倍，毒力也降低，α7为富含螺旋结构的结构域Ⅰ上最后一个螺旋，它连接结构域Ⅰ和结构域Ⅱ，利用白喉毒素B片段替换CrylAcα7上疏水片段，发现与野生型相比，其对棉铃虫(H.armigera)一龄幼虫毒力提高8倍之多，LC50值为2.5 ng/cm

1.2结构域Ⅱ的突变

结构域Ⅱ由200多位氨基酸残基组成，是一个高度可变区，具有3个反平行的β片层结构，并形成3个暴露在外的loop结构，突变其上氨基酸残基可以确定loop是否与受体结合有关，MiKyong Lee等人曾报道CrylAc DomainⅡα8 loop上275～293位的Arg被Ala替换后，R281A和R289A对烟草天蛾和舞毒蛾(Lymantria dispar)毒力都大大降低，与BBMV的结合亲和力也降低，还有研究表明R368、R369很大程度上影响毒力的发挥，与BBMV结合及对烟草天蛾和舞毒蛾APN的结合，双突变子R368/R369表明带正电荷的氨基酸在与BBMV的初始识别中起重要作用1111Florence Coux等人实验证明：CrylAa的4个盐桥对毒蛋白的结构和功能是很重要的，R265A和D242A/R265A对胰蛋白酶处理敏感，R233A、R234A、D242A pH 10.5和D222A pH 7.5时离子通道形成能力比野生型强，说明盐桥的去除有利

于中肠膜插入，却使毒力下降，离子通道活性的增强使毒素对胰蛋白酶处理更敏感，尤其Asp242～Arg265盐桥，对毒蛋白稳定性作用显著，说明DomainⅡ在离子通道形成，中肠膜插入过程中也起到一定作用，Francis Raiamohan等人突变CrylAb DomainⅡ370～375位残基(FNIGI)，结果N372A和N372G对吉普赛蛾(Gypsy Moth)的LC50值分别为34ng/cm2和35ng/cm2，比野生型毒力提高8倍之多，而与BBMV的结合亲和力比野生型分别提高了4倍，然而去除N372将会大大降低其毒力和亲和力，说明N372在受体结合中起作用，三突变子N372A/A282G/L283S LC50值为8.0 ng/cm2，比野生型毒力提高了36倍，其毒力的提高与高结合亲和力及结合时浓度有关，解离结合实验也表明三突变子毒素结合力比野生型和N372高出4倍之多，除1373A外，其它突变子都对中肠液和胰蛋白酶处理稳定，D2(删除370和375)、F371A和G374A毒力丧失很大，N372A和1375A则只降低2倍，同源、异源竞争结合实验表明，不可逆结合中具有毒力的N372A、1375A只有20％～25％与BBMV解离，而毒力降低的D2、F371A和G374A则50％～55％与BBMV解离，电压钳实验也进一步证明杀虫特异性直接与BBMV的不可逆反应有关，F371A不影响初始结合，但是不可逆结合减少，说明CrylAb DomainⅡ上突变不会影响毒蛋白的整体结合，但会影响不可逆结合，Cristopher Padilla等人实验证明：117、219、226和455位高疏水性残基被Cys替换后影响了晶体的形成，与被Phe替换相比毒力更低，此外219、316、455位氨基酸残基突变影响了与BBMV的结合，Munah Abdul Rauf等人将CrvlC DomainⅡloop2，loop3上残基突变，发现杀虫特异性和初始结合都受到影响，Q374N、P375A、W376Y、P377A对海灰翅夜蛾(5.Littoralis)毒力变化不大，而对埃及伊蚊(A.aegypti)毒力则大大降低，另外这些突变子与受体结合力的差别很大，对于不同靶标昆虫的毒力也不同，以上实验结果表明DomainⅡ主要影响毒蛋白与受体的结合，也在蛋白酶水解，中肠膜插入和杀虫特异性方面起到一定作用，一般来说毒力的改变与受体结合存在一定关系，但也有特例，以上某些位点的突变可以证明这点，毒力的改变并不一定与受体结合成正相关，相对保守的盐桥的突变实验结果也表明DomainⅡ在维持蛋白结构的稳定性和中肠膜插入方面起到重要作用。

1.3结构域Ⅲ的突变

结构域Ⅲ具有两个反平行的β片层的三明治结构，主要在维持毒蛋白结构的稳定性上起作用，同时还与杀虫特异性有关，在与受体的结合、离子通道的形成、中肠膜插入中也起一定作用，JLSchwaaz等用Ala替换CrylAc DomainⅢ上503～525位的氨基酸残基检测其在毒力和受体结合方面的作用，发现509QNR511、509Q、511R、513Y突变为Ala后毒力及与BBMV的结合亲和力降低，所有突变子在胰蛋白酶或中肠液处理时都能产生稳定的毒素片段，结果表明509Q、511Q、513Y在与受体的初始结合中起作用，Luke Masson等人将CrylAc DomainⅢ上一个高度保守的Arg区域突变，525、527、529、531位Arg突变为Gly或Asp后毒力都下降，在磷脂双层结构实验中，突变子与野生型呈现不同曲线，说明这些保守序列对维持结构的完整性和离子通道形成中发挥作用㈣，突变CrylAa DomainⅢ上胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用位点后发现R543S、R566G、F570S、F576S毒力稍有提高，LD50值分别为3.8、3.2、3.9、1.8 ng，与野生型7.9 ng相比，F576S毒力提高了4倍，R543S、R566G、F570S也都分别提高了2倍，但各突变子对胰蛋白酶处理的敏感性与野生型相似，加入Ser蛋白酶抑制剂后，原毒素还能被中肠液继续降解，说明中肠液中其他蛋白酶被激活而产生了正效应，Cami-10等人证实，杂交体CryAAC(1Ac/1Ac/1Ca)对棉铃虫(M.brassicae)和大菜粉蝶(PieTis brassicae)一龄幼虫毒力与野生型相比有很大提高，但是R423位点对蛋白酶处理很敏感，而杂交体CryAAC R423S毒力大大提高，在中肠液稳定性实验和晶体溶解性实验中，由R423S引起的CryAAC loop卢7/β流动性增强，而使毒力得到提高，说明蛋白酶作用位点的改变有利于毒力的提高，CrylAa DomainⅢblock4 521～527序列为RYRVRIR，是一个富含Arg的高度保守的区域，形成一个带正电的高度疏水表面，它通过侧链和R525形成的氢键和与254位的羰基氧原子而与Domain I发生分子内相互作用，从而起到连接Domain I和DomainⅡ的作用，在这一区域的突变子中，R521H离子通道形成能力大大降低，其它突变子R521K、R521Q、R527K离子通道形成能力也都稍有降低，在磷脂双层结构实验中，R521H、R527K的中肠膜插入能力降低，有趣的是，最保守的R521K和最不保守的R521E对离子通道形成能力的影响相似，而R521H替换则无影响，说明Arg区域突变只是CrylAa通道形成能力的一个小的决定因子，其它因素如残基大小、侧链位置、分子内或分子间相互作用也会产生一系列影响，这些结果表明Domain I和DomainⅢ上Arg的相互作用很大，并且其作用也不仅仅依赖于这些突变的残基。

2结语

根据以上实验结果，我们可以得知杀虫晶体蛋白作用机制：

1)毒素是通过先插入由疏水性的α5和两亲性的α4螺旋组成的发夹插入昆虫中肠膜，形成孔道，位于DomainⅢblock4上残基与β17上残基形成的氢键和羰基氧原子，连接了Domain I和DomainⅡ，从而在离子通道形成中发挥作用。

2)DomainⅡ参与受体结合，包括初始结合和不可逆结合，并且在一定程度上影响杀虫特异性，其上的保守区域对维持杀虫晶体蛋白三维结构的稳定性具有一定作用。

3)DomainⅢ上β17在离子通道和插入中肠膜的过程中起作用，由此推断DomainⅢ参与了离子通道形成和插人中肠膜过程。

随着利用定点突变技术对苏云金杆菌研究的深入，对改变其杀虫谱窄，对昆虫致死时间长，诱导昆虫产生抗性的问题将有可能得到解决，很有希望研究开发出高效、广谱、速杀、抗抗性的Bt杀虫剂，本研究室根据突变胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用位点，可以激活中肠液中其他蛋白酶的作用，产生正效应，而选取突变位点，目前已筛选到高毒力的突变菌株，杀虫效果比野生型菌株好，随着对杀虫晶体蛋白结构和作用机理的不断深入研究，通过各种途径改造杀虫晶体蛋白分子结构，构建高效，广谱的工程菌株是完全有可能的。