种质研究论文：RAPD在种质研究的运用

本文作者：于华平1程晓建1房经贵2宋长年2作者单位：1浙江广播电视大学2南京农业大学

RAPD标记在果树种质研究中的应用

1在种质资源起源上的应用

我国是果树的起源中心(多样化中心或基因中心)之一。许多树种栽培历史久远，种质资源极为丰富，经过自然杂交，种质相互渗透，种属间进化上具有很大的同源性。利用RAPD标记可获得物种间DNA水平的多态性资料，了解其主要遗传物质DNA之间的同源程度，从而确定亲缘关系和进化地位。Omura等［12］通过RAPD分析发现温州蜜柑与日本立花橘间的相似系数较小，而与我国浙江黄岩本地早的相似系数较大，从而进一步确认了温州蜜柑起源于中国的观点;吉前华等［13］利用RAPD技术研究了地方优良品种贡柑与部分柑橘属植物之间的亲缘关系，也对贡柑的起源进行了初步的探讨，支持贡柑是由本地橘和橙的自然杂交而来的观点，并偏向橘遗传基础。亲本的确立可以为育种者选配育种亲本提供有用的信息。由于许多果树栽培品种最初从实生苗而来，父母本不清，RAPD标记为亲本的确立提供了一种有效手段。Harada等［14］根据RAPD分析结果认为，乔纳金(金冠×红玉)和陆奥(金冠×印度)2个三倍体苹果品种其减数分裂的2n配子是由金冠提供的，这一结果与以前的同工酶分析结果一致。津轻苹果的父本因当时记载不详一直不得而知，结合RFLP和RAPD分析结果确认其父本为红玉。程中平［15］利用RAPD分子标记技术并结合前人在形态学、细胞学、孢粉学和酶学的研究结果，认为桃、李、杏、梅、樱类植物可划分为桃属、李属、杏属和樱属，其中桃属是最进化的类型，这与俞德浚将大李属细划为4个小属的观点一致［16］。这些研究充分说明了RAPD技术作为一种分子鉴定的有力工具，已经成为了传统形态学，细胞学和同功酶分析鉴定物种的有力补充。

2在种质资源的遗传多样性和亲缘关系上的分析

遗传多样性是物种适应自然和进化的基本特征，它源于核酸序列不同和基因突变。天然植物群体的遗传多样性程度受遗传漂变、迁移、突变和选择等综合因素的影响，其基因频率会在一定的水平上波动，反映在核酸水平上就会呈现出特定DN段的多态性。因此，利用RAPD技术对遗传多样性进行快速检测，可以避免受环境、组织特异性和发育阶段的影响。冷翔鹏等［17］利用RAPD和SSR2种标记分别对系谱关系明确的22个巨峰系葡萄品种进行聚类分析，以验证2种标记方法的正确性与可靠性。结果显示，2种分子标记聚类结果基本一致，均适合于巨峰系葡萄的系谱分析和种质遗传多样性研究;Luro等［18］应用RAPD技术证明了宽皮柑橘品种间高度的遗传多样性，说明在宽皮柑橘品种的演化中起主要作用的是有性杂交和性状重组;在桃的遗传多样性研究方面，程中平等［19］用RAPD标记技术对203份桃属材料进行遗传多样性研究，发现砧木类遗传多样性指数最高，红叶桃、蜜桃、蟠桃和黄肉桃次之，寿星桃、碧桃、垂枝桃、硬肉桃和水蜜桃最低;谭晓风等［20］对香榧8个主要栽培种用RAPD进行分析，聚类结果与传统形态学的2大类基本吻合;为了探讨梅的2种类型———花梅与果梅的遗传多样性，王玉娟等［21］利用改良的RAPD技术对25个花梅和21个果梅品种的基因组总DNA进行了分析，并在此基础上采用UPGMA聚类方法对花梅与果梅品种间的遗传关系进行了分析。结果显示:花梅和果梅各品种间具有丰富的遗传多样性。聚类分析结果显示花梅和果梅具有相近的亲缘关系，遗传背景相似。

3种质资源的鉴定

1）品种鉴定和指纹图谱绘制

果树大多是多年生木本植物，且主要采用无性繁殖。长期以来，不同地域相互引种栽培致使出现了许多同物异名和同名异物现象，品种名和品种分类十分混乱。对现有果树品种准确地鉴定和分析，是进一步科学有效地利用果树资源的基础。过去进行品种分类和鉴定主要采用比较形态学并结合细胞学、孢粉学和酶学等方法，这些方法对关系较近的材料不能准确区分。近10多年来，发展起来的分子标记技术为品种鉴定开辟了新的技术手段。吉前华等［22］利用梯度PCR优化了RAPD反应条件，建立了RAPD-PCR分析的最佳反应体系，显著提高了柑橘RAPD分析的特异性、效率和稳定性。结果证明，RAPD分析是品种纯度鉴定研究的简单实用的方法。潘新法等［23］运用RAPD分析技术，对16个枇杷品种的基因组DNA进行RAPD分析，表明不同枇杷品种基因型间存在着极为丰富的遗传多样性，扩增的DNA指纹图谱可将16个品种一一区分，为枇杷品种鉴定提供新的方法，同时也为分子标记辅助育种提供了依据;乔玉山等［24］以奉化李为试材，对中国李RAPD反应体系进行了优化，利用该优化反应体系，用10个随机引物，构建了5个中国李品种的RAPD指纹图谱，并以共有谱带率对这些品种遗传关系进行了分析;Harada等［25］用1个RAPD引物区分出了38个苹果品种。此外，在香蕉、龙眼、梨、柿、等作物上也开展了这方面的研究工作。

2）突变鉴定

果树在长期的无性繁殖过程中，形成了形形的突变类型，通过分子标记也可以发现众多突变类型，多数芽变是源于原有品种的微小变化，采用形态学、同工酶分析难以鉴定，借助分子标记在一定程度上可提高芽变鉴定的成功率。对于不同的果树芽变类型，RAPD标记技术表现出不同的鉴定可行性。房经贵等［26］对RAPD标记应用于果树芽变鉴定中的可行性进行了探讨;金勇丰等［27］用RAPD标记分析桃品种布目早生和其早熟芽变大观1号基因组DNA多态性，筛选出1个引物可检测出两者间的多态性;Kaemmer等［28］与Yang等［29］利用RAPD分别成功地鉴别出香蕉和甜樱桃的芽变系。RAPD标记在其他突变体的鉴别上也有应用。如张开春［30］曾采用RAPD标记将苹果品种红星和其短枝型突变体新红星等区别开;Sagawara等［31］还鉴定了几个柑橘嵌合体;刘成明等［32］对荔枝怀枝和三月红及其焦核芽变进行了RAPD分析，分别获得了OPL-121645和OPL-127222个特异性片段，初步认为这2个片段与焦核性状有关。

3）体细胞杂种的鉴定

现代栽培作物的遗传基础狭窄是作物改良的一个主要障碍，通过远缘杂交、体细胞杂交等方法导入外源遗传物质，是扩大遗传多样性的主要途径。史永忠等［33］通过优化条件，建立起柑橘RAPD分析体系并成功地应用于体细胞杂种的鉴定;肖顺元等［34］采用RAPD分析准确无误地鉴别了Volbaner柠檬与酸橙的体细胞杂种;Sawazaki等［35］应用RAPD鉴定出了欧洲葡萄与圆叶葡萄杂种。

4）种质保存和核心种质的建立

RAPD技术可以为种质资源的研究提供几乎无限的多态性证据。通过进行资源鉴别，可以避免在资源保存中经常发生的重复、混淆，为种质资源保存提供科学的依据。

存在问题及展望

对RAPD的稳定性和重复性差的缺陷，许多研究者通过优化反应条件，严格控制反应程序中各个环节参数，选用适合品种的引物等多种措施改善和提高。在今后的研究中仍需对RAPD技术进行改进，使其成为更简便、准确、有效、安全、廉价的检测手段。尽管RAPD技术在我国果树研究中应用还较有限，主要用在物种进化、品种分类、杂种鉴定等方面，但是已有许多果树构建了分子图谱与目的基因紧密连锁的稳定的标记正在不断地挖掘，可以预见随着分子生物学的发展RAPD技术在不断完善的同时，也必将在果树研究中发挥越来越大的作用。