柑橘黄龙病菌及其分子检测研究进展

摘要 柑橘黄龙病是世界柑橘生产人毁灭性病害。该文介绍该病的病原认识过程、病害的主要特征及病害的检测方法，包括常规PCR法、巢式PCR法、荧光实时定量PCR法、DNA杂交法、滚环介导的等温扩增（LAMP）法等。

关键词 柑橘黄龙病；分子生物学；检测

中图分类号 S436.66 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）14-0132-02

柑橘黄龙病作为一种严重的侵染性细菌性病害，最早在我国广东潮汕地区发现，后逐渐蔓延至四川、福建、广西、海南、江西、云南、台湾、湖南、贵州和浙江等省区，一旦发生即对植株造成毁灭性危害。近年来，柑橘黄龙病也广泛分布于东南亚、非洲南部、南美洲、北美洲等地。各个国家针对柑橘黄龙病的研究过程中曾有过多个名称，如立枯病（Likubing）、叶斑驳病（Leaf Mottle）、梢枯病（Dieback）、青果病（Greening）等。为了纪念最先通过嫁接方法证实黄龙病是一种传染性病害的林孔湘教授，于第13届世界柑橘大会决定统一用HLB（Huanglongbing）来命名柑橘黄龙病。

1 柑橘黄龙病原的认识过程

林孔湘通过嫁接的方法，发现该病能株间传播，肯定该病的病原是病毒[1]。Lafleche和Bové通过电镜观察认为是类支原体（MLO）[2]。Moll等依据黄龙病病原的包膜厚度将其归类为类细菌体（BLO）[3]，Villechamoux 等[4]发现高度保守的细菌GrplKAjL-rpoBC操纵子与亚洲黄龙病菌的某段DNA核糖体蛋白一致，从而确定黄龙病原属于真细菌。目前已经完成了黄龙病原的全基因组测序，病原全基因组的大小为1.15～1.23 Mb，其中含有噬菌体的基因组，初步确定该病害是由限制于韧皮部的难养细菌“Candidatus Liberibacter spp.”引起[5]，该病原是一种革兰氏阴性细菌，还未能进行人工培养，无法完成科赫氏法则检验，严格意义上还不能对其正式命名，该菌可能是根瘤菌的一个早期分支[6]。根据传播媒介和病原的热敏性及病原菌16S rDNA和β-操纵子基因的序列特征，将柑橘黄龙病菌分为非洲种、亚洲种、美洲种。

2 柑橘黄龙病害表现

病害初发生时，有1～2条黄梢出现在树冠中，之后黄梢数量不断增多，最后发展为整株黄化。叶片表现为均匀型或斑驳型黄化，均匀型黄化主要是新梢不转绿，斑驳型黄化主要从叶片的基部和边缘开始发黄，黄绿相间，呈现斑驳状，染病早期，叶片常显现为斑驳型黄化，待病菌散播到全树后，新梢抽生的叶片一般为均匀黄化。果实的典型症状是着色异常、果小、畸形、无光泽、味酸，难褪绿，或果蒂和果肩周围先褪绿转色，其他部位仍然为青绿色，形成“红鼻子果”或“红肩果”。感染黄龙病的柑橘种子质量减轻，多败育且萌发率降低。黄龙病后期病株，根系发生腐烂，木质部变黑皮层，易与下层组织分离。柑橘类植物感染黄龙病菌后并不立即显症，存在潜伏期。潜伏期的长短因品种、树龄、健康状况、种植环境等而异。

3 柑橘黄龙病的检测方法

田间诊断与指示植物检测、显微镜观察、生化指标鉴定、免疫学检测和基于核酸的分子生物学检测等方法均可作为柑橘黄龙病的检测方法，但前几种方法由于检测周期长或准确性及灵敏度不高，存在着局限性。基于核酸的分子生物学检测快速、准确，目前的检测方法主要集中在常规PCR法、巢式PCR法、荧光实时定量PCR法、DNA杂交法、滚环介导的等温扩增（LAMP）法等。

3.1 常规PCR检测

自1992年Villechanoux[7]开始陆续克隆、测序柑橘黄龙病病原序列以来，黄龙病的PCR检测开始得以迅猛发展。Jagoueix等设计通用引物OI1/OA1/OI2c，扩增片段长度为1 160 bp，用以检测黄龙病的亚洲种和非洲种，结果发现：非洲种被酶切为2个片段（640 bp、520 bp），亚洲种被酶切为3个片段（520 bp、506 bp、130 bp）[8]。Hocquellet等[9]设计引物A2/J5，通过PCR产物长度的不同（亚洲种700 bp，非洲种650 bp）对其进行鉴别。Teixiera等[10]根据16S rDNA的序列设计了一套引物GBl/GB3，能够检测美洲柑橘黄龙病菌，扩增子长度为1 027 bp。Subandiyah等[11]设计了大小为893 bp的OI2/23S1-rev引物扩增片段，以检测亚洲地区的黄龙病菌。丁 芳等[12]研究结果发现常规PCR技术可以检测出未显症状的黄龙病材料。

3.2 巢式PCR检测

Harakava等[13]研究结果表明巢式PCR检测相对于常规PCR检测灵敏度有所提高。丁 芳等[12]比较了常规PCR和巢式PCR技术，发现巢式PCR检测病原DNA数量级约为常规PCR的10 000倍。李 韬等[14]研究表明巢式PCR可检测到1头带菌木虱，灵敏度较常规PCR提高。鹿连明等[15]通过常规和巢式PCR方法对8对引物的检测灵敏度进行了比较，结果表明：不同引物的检测灵敏度不同，但巢式PCR的灵敏度均比常规PCR至少高1 000倍。值得注意的是巢式PCR可能出现假阳性，要注意避免。

3.3 定量PCR检测

田亚南等[16]研究结果表明：虫媒柑橘木虱体内的病原含量最多，其次为长春花，而柑橘中的病原含量较少。Li等[17]设计了特异性探针引物，HLBaspr、HLBafpr和HLBampr用于检测和鉴定柑橘黄龙病菌已知的3个亚型，检测灵敏度为每个反应1～10个16S rDNA拷贝，PCR扩增效率达到99.90%。胡 浩等[18]利用2种探针检测柑橘黄龙病。廖晓兰等通过克隆获得了亚洲黄龙病病原的16S rDNA基因序列，建立了实时荧光PCR检测方法，只用0.2 g植物材料即可用于检测，比常规PCR法灵敏度高100倍。胡 浩等研究结果表明荧光定量PCR方法的灵敏度比常规PCR高出至少2～3个数量级。荧光定量PCR方法的灵敏度比常规PCR高出至少10～100倍，而TaqMan探针法使用了杂交探针，特异性尤其可靠。定量PCR检测还可用于监测柑橘体黄龙病菌数量的周期性变化情况。

3.4 DNA杂交

DNA杂交是用一段已知序列的放射性或非放射性标记的核苷酸单链做探针，和待测核酸进行杂交，然后通过标记探针放射自显影或尼龙膜显影即可达到检测的目的。Villechanoux等自1992年开始使用探针In2.6检测黄龙病亚洲种[7]，并在1995年使用探针As1.7检测黄龙病非洲种[19]，DNA-DNA杂交准确性达到电镜检测的水平，灵敏度达到检测单头柑橘木虱的水平。Garnier等利用斑点杂交技术成功检测了印度等地的亚洲黄龙病，其后又开发了非洲黄龙病探针。Hocquellet A等[20]使用地高辛做标记，制备了不含放射性元素的探针。但该方法DNA用量大、杂交过程较为复杂、检测周期较长等因素限制了该技术的广泛应用。

3.5 滚环介导的等温扩增（LAMP）

LAMP是Notomi等于2000年发明，该技术针对靶基因的6个特定区域设计4条特异引物，借助具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件下进行靶序列高效扩增，具有简便、高效，成本低、检测周期短等优点，检测结果可用肉眼判断。Okuda等[21]根据黄龙病菌亚洲种的nusG-rplKAJLrpoB基因簇区设计引物，针对黄龙病菌亚洲种进行LAMP技术检测，其结果显示检测灵敏度与常规PCR一致。黄 丽等[22]在特异保守区域设计2对特异性引物，建立了柑橘黄龙病菌亚洲种LAMP快速检测技术，对柑橘样品进行LAMP扩增，仅黄龙病阳性样品扩增产物电泳呈特征性梯状条带，其灵敏度比常规PCR高100倍，与荧光定量PCR相当。王贤达等[23]针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物，采用可视化LAMP检测技术，对柑橘黄龙病菌总DNA进行检测，发现检测限为1.51×10-3 ng/μL，灵敏度同样可与定量PCR相当[24]。

4 结语

柑橘黄龙病可防不可治，准确检测植株是否染病是黄龙病防控工作的首要环节，随着分子生物学的快速发展和柑橘对黄龙病病原菌研究的不断深入，黄龙病的分子检测技术也在日新月异的进步，利用核酸检测灵敏、快速、便捷，是目前较为可行且准确性较高手检测方法。各种核酸检测方法在检测时间、准确性、灵敏度、检测成本上也还存在较大差别，可结合实际情况，因地制宜选择合适的方法。

5 参考文献

[1] 林孔湘.柑橘黄梢（黄龙）病的进一步研究[J].植物保护学报，1963，3（2）：234-251.

[2] GARNIER M，BOVE J M.Citrus greening disease and the greening bacterium[A].Proc.12th Conf IOCV[C].Riverside：IOCV，1993，212-219.

[3] MOLL J N，MART M parison of organism causing greening disease with several plant pathogenic gram negtive bacteria，ricket tsia-like organisms，and mycoplasma-like organisms[J].Coll INSERM，1974（ 33）：89-96.

[4] VILLECHANOUX S，GARNIER M，RENAUDIN J，et al.Detection of several strains of the bacterium-like organism of citrus greening disease by DNA probes[J].Current Microbiology，1992，24：89-95.

[5] SAGARAM U S，DE ANGELIS K M，TRIVEDI P，et al.Bacterial diversity analysis of huanglongbing pathogeninfected citrus，using phylochip arrays and 16S rRNA gene clone library sequencing[J].Applied and Environmental Microbiology，2009，75（6）：1566-1574.

[6] DUAN Y P，ZHOU L J，HALL D G，et plete genome sequence of citrus huanglongbing bacterium，‘Candidatus liberibacter asiaticus’ obtained through metagenomics[J].Molecular Plant-Microbe Interaction，2009，22（8）：1011-1020.

[7] VILLECHANOUX S，GARNIER M，LAIGRET F，et al.Detection of se-veral strains of the bacteria-like organism of citrus greening disease by DNA probes[J].Curr Microbiol，1992（24）：89-95.

[8] JAGOUEIX S，BOVE J M，GARNIER M.PCR detection of two Candidatus.liberobacter species associated with greening disease of citrus[J].M olecular and Cellular Probes，1996（10）：43-50.

[9] HOCQUELLET A，TOORAWA P，BOVE J M，et al.Detect ion and id-entification of the two can didatus liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal proteingenes of the Boperon[J].Molecular and Cellular Probes，1999（13）：373-379.

[10] TEIXEIRA D C，SAILLARD C，EVEILLARD S，et al.'Candidatus Libe-ribacter americanus'，associated with citrus huanglongbing（greening disease） in Sao Paulo State，Brazil[J].Int.J.Syst.Evol.Microbiol，2005，55：1857-1862.

[11] SUBANDIYAH S，IWANAMI T，TSUYUMU S，et parison of 16S rDNA and 16S/23S intergenic region sequences among citrus greening organisms in Asia[J].Plant Disease，2000，84（1）：15-18.

[12] 丁芳，易干军，王国平.应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究[J].园艺学报，2004，31（ 6）：803-806.

[13] HARAKAVA R，MARAIS L J，OCHASAN J K，et al.Improved sens-itivity in the detection and differentiation of citrus Huanglongbing bac-teria from South Africa and the Philippin es[A].Proc 14th ConfIOCV[C].Riverside：IOCV，2000，195-199.

[14] 李韬，柯冲.应用Nested PCR 技术检测柑桔木虱及其寄主九里香的柑桔柑橘黄龙病带菌率[J].植物保护学报，2002，29（1）：31-35.

[15] 鹿连明，胡秀荣，张利平，等.常规和巢式PCR 对柑橘黄龙病菌的检测灵敏度比较[J].热带作物学报，2010，31（8）：1280-1287.

[16] 田亚男，柯穗，柯冲.应用多聚酶链式反应（PCR） 技术检测和定量分析柑桔黄龙病病原[J].植物病理学报，1996，26（3）：243-250.

[17] LI W，HARTUNG J S，KVY L.Quantitative real-time PCR for detection and identification of Canddatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing[J]. Journal of Microbiological Methods，2006，66：104-115.

[18] 胡浩，殷幼平，张利平，等.柑橘黄龙病的常规PCR 及荧光定量PCR 检测[J].中国农业科学，2006，39（12）：2491-2497.

[19] PLANET P，JAGOUEIX S，BOVE J M，et al.Detection and characterz-ation of the African citrus greening liberobacter by amplification，clo-ning and sequencing of the rplKAJL-rpoBC operon[J].Curr Microbiol，1995（30）：137-141.

[20] HOCQUELLET A，BOV J M，GARNIER M，Production and evaluation of non-radioactive probe the detection of the two“Candidatus Liber-obacter”species associated with citrus huanglongbing（greening）.Mol Cell Probes.1997，11（6）：433-438.

[21] OKUDA M，MATSUMOTO M，TANAKA Y，et a1.Characterization of the tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB gene cluster of the citrus greening organism 3.d detection by loop-mediated isothermal amplification[J].PlantDisease，2005，89（7）：705-711.

[22] 黄丽，苏华楠，唐科志，等.柑橘黄龙病LAMP 快速检测方法的建立及应用[J].果树学报，2012，29（6）：1121-1126.

[23] 王贤达，林雄杰，胡菡青，等.柑橘黄龙病可视化LAMP 检测技术的建立及应用.热带作物学报2014，35（5）：918-924.

[24] 程春振，曾继吾，钟云，等.柑橘黄龙病研究进展[J].园艺学报，2013（9）：1656-1668.