大鼠二次脑挫伤模型的建立

摘要：目的 尝试建立一种存在二次脑挫伤的大鼠模型。方法 成年SD大鼠，性别不限，随机分为三组：假手术组、一次脑挫伤组及二次脑挫伤组。利用自由落体打击装置，对一次脑挫伤组大鼠进行一次打击，二次脑挫伤组在初次打击基础上1h后不同部位进行二次打击；一次脑挫伤组分别于打击后0h、1h、2h后取材，二次脑挫伤组于第二次打击后1h取材。采用激光扫描共聚焦显微镜检测技术对脑挫伤周围C-FOS蛋白阳性细胞数进行观察。结果 大鼠脑挫伤后脑皮质挫伤区周围C-FOS阳性细胞显著增高（P

关键词：法医病理学；脑挫伤；C-FOS；动物模型

Rat Brain Contusion Model with Twice Traumatic Brain Injuries

DONG Guo-kai1，XUE Hong-tao2，XIE Hua3，SUN Xiao-ming1，YIN Wen-jiang1，LI Zhou-ru1

（1.Department of Forensic Medicine， Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002， Jiangsu，China；2. Criminal Police Brigade of Tongshan Public Security Bureau，Xuzhou 221100， Jiangsu，China；3. Criminal Police Brigade of Xinyi Public Security Bureau， Xuzhou 221400， Jiangsu，China）

Abstract：Objective To establish a brand new rat model for researches after twice traumatic brain injuries in forensic investigation. Methods Mature SD rats were classified into 3 groups randomly， A： sham-operated group， B： brain injury once， and C： brain injury twice， without restriction of gender. The injuries were introduced using a free fall device to the left side of the brain of rats in group B and C. 1 hour later， the same injure was introduced to the other side of the brain of rats in group C. Samples were taken at 0h， 1h， 2h after injury for group B. For group C， both sides were sampled 1h after the second injury. The expression of C-FOS protein was tested as indicator for injury with laser scanning confocal microscope together with the computer colorful image analysis technique. Results The C-FOS expressed differently in the pan-injury areas between group B and C at different time point （ P

Key words：Forensic pathology；Brain injury；C-COS；Animal model

部分交通事故、高坠、打架斗殴等案件中，存在外伤后伪造车祸、高坠及二次撞击等初次颅脑外伤后再次外伤的情况，能否准确判断是否存在二次外伤是法医病理学的难题。在目前法医实践中尚无确切依据，主要是靠法医自身经验及案情调查。现有二次脑损伤模型主要是外伤性脑损伤之后复合低血压、低氧血症等，用于临床基础研究[1]，尚无一种模型能够满足二次颅脑外伤的法医学研究。脑挫伤是常见的机械性损伤[2]，研究发现，脑挫伤后脑皮质挫伤区C-FOS阳性表达短时间内即呈上升趋势[3-6]。本实验利用自由落体打击装置，在脑挫伤模型基础上，对大鼠初次脑挫伤后不同部位再次打击，应用激光扫描共聚焦显微镜检测技术，了解C-FOS在大鼠初次脑挫伤与二次脑挫伤后的表达差异，探索建立二次脑挫伤模型。

1资料与方法

1.1一般资料 健康SD大鼠25只（徐州医学院实验动物中心提供），雌雄不限，体质量160～220g。C-FOS一抗 （sc-34273），AP标记的二抗（Sigma Chemical公司），驴抗兔荧光二抗（A21207， Invitrogen公司），BCA试剂盒 （浙江碧云天生物试剂有限公司）。ZH-ZYQ 型自由落体脑损伤模型打击器（淮北正华生物仪器设备有限公司），FV1000 激光共聚焦显微镜（日本Olympus 公司），JD801 病理图像分析系统。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型的建立 健康SD大鼠25只随机分为假手术组（5只）、一次脑挫伤组（15只）、二次脑挫伤组（5只）。一次脑挫伤组按照颅脑损伤后处死时间不同又分为一次脑挫伤0h、1h、2h三个亚组，每个亚组5只大鼠，二次脑挫伤组于第一次打击后1h于不同部位进行第二次打击，第二次打击后1h处死大鼠。

1.2.2大鼠二次脑挫伤模型的建立 利用自由落体脑损伤模型打击器建立模型：大鼠用20%水合氯醛（350 g/kg）腹腔麻醉后俯卧位固定头部及四肢，除去头皮处鼠毛。用手术刀切开大鼠头部中线皮肤，切口后端以45°角分别向两侧剥离骨膜，充分暴露双侧顶部颅骨，分别在双侧人字缝前、矢状缝旁分别钻直径5mm圆形骨窗，保持硬脑膜完好，将撞杆头端置于骨窗硬脑膜外。一次脑挫伤组利用自由落体脑损伤模型打击器，以30g打击棒从25cm高度落下冲击撞针，造成大鼠左侧局部脑挫裂伤；二次脑挫伤组在一次脑挫伤后1h以同样方法形成右侧局部脑挫裂伤。假手术组采用同样麻醉及手术步骤，但不用打击棒打击动物头部，一次脑挫伤组不打击右侧骨窗，所有大鼠处死后均在大脑两侧进行取材。

1.2.3激光扫描共聚焦显微镜技术检测细胞内C-FOS蛋白表达 建立大鼠脑挫伤模型后取不同时间点，用20%水合氯醛 （350mg/kg）腹腔麻醉大鼠，于剑突下横向沿胸壁左右向剪开暴露心脏，用平头穿刺针从心尖插入左心室，剪开右心耳，依次用生理盐水、4%多聚甲醛灌注，断头取脑，置于4%多聚甲醛后固定6h，30%的蔗糖脱水至脑组织下沉，OCT包埋。切片，厚度25μm。取冰冻切片，0.4%的Triton X100-PBS打孔15min，4℃血清封闭1h，加入C-FOS一抗4℃过夜，0.1% Triton X100-PBS洗涤5min×3次，加入荧光二抗，避光室温孵育2h，甘油-PBS封片，激光共聚焦显微镜 （Olympus FV1000） 扫描图片。红色荧光为C-FOS，代表C-FOS的阳性细胞。

1.3统计学分析 Fos阳性以个数表示，用计算机图像分析系统 （200×）显微镜下分别记数，所有数值均用平均数±标准差（x±s）表示，组间、组内比较用？字2 检验，P

2结果

假手术组大鼠脑皮质C-FOS阳性细胞数较少，在外伤后2h脑挫伤周围C-FOS阳性细胞内显著增高（P

假手术组、一次脑挫伤0h组双侧脑皮质及一次脑挫伤1h、2h组打击部位对侧有少量C-FOS表达；与假手术组比较，一次脑挫伤1h、2h组脑挫伤周围及二次脑挫伤组双侧脑挫伤周围C-FOS表达显著增高（1P

3讨论

目前有包括自由落体、液压冲击、旋转加速等多种创伤性脑损伤模型[7-10]，用于研究脑损伤发生机制及神经损伤后修复。在法医病理学方面，常见采用自由落体装置模拟颅脑损伤[11]，该方法简单实用、可行性强，且可以在打击部位形成局部脑挫伤，在此基础上有较多关于颅脑损伤时间推断的研究，主要采用观察外伤后不同时间点脑组织形态学改变及分析相关蛋白表达的方法，并且发现脑挫伤后一些蛋白的表达有时间规律性[12-14]。在当前法医实践当中，一些案件存在二次外伤的情况，目前关于鉴别初次外伤与二次外伤的研究较少，我们在自由落体装置模拟颅脑损伤的基础上，在大鼠颅脑两侧不同时间点分别打击，尝试建立二次脑挫伤模型。研究发现，C-FOS是神经细胞最常见的即刻早期基因之一，损伤、缺血等外界因素可迅速诱导C-FOS蛋白表达，已被广泛作为神经细胞功能的标志物，用于脑损伤时间的推断[3]，实验中观察脑挫伤周围C-FOS阳性表达量并与未受外伤处进行比较。

本实验表明，C-FOS蛋白在脑挫伤周围2h内表达逐渐增强，与以往研究一致；二次脑挫伤组二次脑挫伤周围C-FOS阳性表达与一次脑挫伤后1h、2h组对侧未打击区存在差异；对大鼠颅脑两侧分别打击，发现间隔1h后，二次脑挫伤周围C-FOS阳性表达与初次脑挫伤周围存在差异。可以认为在大鼠颅脑两侧不同时间点分别打击可以用来复制二次脑挫伤，用于二次颅脑外伤的研究，为判断是否存在二次脑外伤提供了新思路。

在一定时间段内存在二次甚至多次颅脑损伤在当前法医实际检案工作当中并不少见，寻找初次外伤与二次外伤的判断依据是急需解决的问题，理想的二次脑挫伤模型可以为其提供研究基础，颅脑损伤复杂、多样，各种动物模型均有一定局限性，针对二次脑挫伤，本实验在较为成熟的脑损伤模型基础上，初步探索建立了大鼠二次脑挫伤模型，通过观察不同部位脑挫伤区C-FOS表达量验证二次脑挫伤，模型简单实用，有一定可控性，但实验过程中存在样本量、检测指标、实验方法等方面问题，在以后的工作中，需要进一步探索完善。

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