百合多糖含量测定中苯酚-硫酸比色法的微量快速测定

中图分类号：R927.2文献标识码： A文章编号： 1814-8824(2007)-7-0006-02

摘要:目的 研究百合多糖含量测定中苯酚-硫酸比色的微量快速测定。方法 吸取所需测定吸光度的样品200μl于96孔培养板的孔中，在酶标仪上492nm波长处扫描。结果 标准曲线的回归方程为A=0.0180C-0.0042,r=0.9958，市售百合的多糖含量为16.258%,RSD%=1.902%，平均回收率为100.4%。结论 酶标仪测定比分光光度计测定取样量少、简便、快捷。

关键词 百合多糖 苯酚-硫酸比色法 酶标仪 分光光度计

Rapid microdetermination in Phenol-Sulfuric Acid Colorimetry on content of polysaccharide in Lilium Brownii.Bi Hua,Ren Hua-yi.People’s Hospital of Tujia-Miao Autonomous Prefecture of Xinangxi,Huan,416000,China.

【Abstract】Objective To set up a Rapid microdetermination in Phenol-Sulfuric acid Colorrimetry on content of polysaccharide in Lilium Brownii.Methods With Microplate Research Reader (A=492nm)to determine A of each sample.Results The linear regression equations of the standard curve is A=0.0180C-0.0042,r=0.9958,The polysaccharide content in Lilium Brownii.is 16.258%,RSD%=1.902%,mean recovery ratio is 100.4%,Conclusion Compared with that of UV-Visible Spectrophotometer,with Microplate Research Reader to determine content of polysaccharide in Lilium Brownii.has the advantage of microdetermination、rapidness and simple in operation.

【Key words】polysaccharide,Lilium Brownii.Phenlo-Sulfuric acid Colorimetry,Microplate Research Reader,UV-Visible Spectrophotometer.

百合为百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb、百合Lilium browine F.E.Brown var.viridulum Baker或细叶百合Lilium pumilum DC.的干燥肉质鳞叶。甘，寒，归心、肺经。具养阴润肺，清心安神的作用，临床用于阴虚久咳、痰中带血、虚烦惊悸、失眠多梦、精神恍惚等症。现代研究显示百合中主含酚酸甘油酯、苷类、生物碱及多糖等活性成分［1］。其中百合多糖在百合中的含量高达14.47%~16.69%，而多糖在百合的药效发挥中具有十分重要的作用，能够促进机体细胞免疫功能、降低高血糖小鼠血糖、抗氧化和清除羟自由基的作用［2-6］。因此百合多糖含量的高低是决定百合质量的重要因素之一，在百合糖的含量测定中均采用的是以分光光度计测定的苯酚-硫酸比色法，该法操作繁杂、费时费力、用样量大，本研究采用酶标仪的微量快速测定，以克服分光光度计测定的上述缺点。

1 材料

KHB ST-3600自动多功能酶标仪（上海智华医学精密仪器有限公司），D-葡萄对照品（中国药品生物制品检定所），百合（湖南国杏中药饮片有限责任公司），其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 5%苯酚溶液的配制 称以苯酚100g,加铝片0.1g、碳酸氢钠0.05g,蒸馏,收集182℃馏分，称取10g置棕色瓶中，加水溶解并稀释至200ml，摇匀置冰箱中备用。

2.2 百合多糖的提取与精制 称取百合100g,置圆底烧瓶中，分别以95%乙醇800ml、600ml、600ml水浴65℃回流4h、3h、3h，冷水过滤。滤渣加蒸馏水1500ml，水浴65℃回流3次，每次2h,趁热过滤，滤液减压浓缩到200ml，以氯仿：正丁醇（5:1）萃取5次除杂质。水液中加入95%乙醇使含醇量达80%，静置过液，弃去清液，沉淀以无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，60℃烘干，得白色针状百合多糖，备用。

2.3 苯酚-浓硫酸的加入与测定 在待测定的各试管中同步加入1.0ml 5%苯酚溶液，再垂直快速加入硫酸5.0ml,摇匀，放置5min，沸水浴加热15min，取出，流水速冷至室温。各试管以试剂枪精密吸取200μl于96孔培养板的孔中，每样加3孔，在492nm波长处扫描，打印各孔的读数。

2.4 标准曲线的制备 精密称取于干燥D-葡萄糖对照品25.0mg置于100ml容量瓶中加蒸馏水至刻度。精密吸取0.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml、12.0ml、14.0ml分别置于50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。各精密吸取2.0于15ml具塞试管中，加塞，待作上述2.3项操作。以光吸收值（A）为纵坐标，葡萄糖含量（C）为横坐标，在电脑中作回归，得回归方程为：A=0.0180C-0.0042,r=0.9958，葡萄糖在10.0μg/ml-70.0μg/ml范围内线性良好。

2.5 换算因子的测定 精密称取百合多糖10.0mg置于100ml容量瓶中加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，精密吸取2.0ml于15ml具塞试管中，加塞，待作上述2.3项操作。以回归方程计算测定的百合多糖含量（C），根据实际加入的总多糖量（W），计算其换算因子f=W/C=2.214。

2.6 样品含量测定 精密称取市售百合10g,以95%的乙醇100ml、80ml、80ml水浴65℃回流3h、2h、2h，趁热过滤，以95%的热乙醇20ml洗涤滤渣。将滤渣置圆底烧瓶中，加蒸馏水100ml水浴65℃回流提取4h，趁热过滤，以10ml左右的热水洗涤烧瓶与滤渣。滤液冷却后移于250ml量瓶中并加蒸馏水至刻度，摇匀，作供试液，精密量取2.0ml于15ml具塞试管中，加塞，待作上述2.3项操作。按下式计算样品中多糖含量：多糖含量（%）=（C×F×f×100）/M，式中C为测出的葡萄糖浓度，F为稀释因素，f为换算因子，M为百合的取样量（本实验为10g）。测定市售百合样品3种，结果见表1。

2.7 精密度测定 取1号样品6份，同2.6项操作，结果见表1。计算出RSD%=1.902%。

2.8 回收率测定 精密称取干燥D-葡萄糖对照品10.0mg，置于10ml容量瓶中加蒸馏水至刻度，摇匀，精密吸取0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml于已加入2.0ml供试液的10ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。分别精密吸取2.0ml于15ml具塞试管中，作上述2.3项操作。计算其回收率范围为98.9%~101.7%，平均回收率为100.4%。

3 讨论

百合多糖是中药百合中的重要性物质，以分光光度计进行的苯酚-硫酸比色法是百合多糖含量测定的常用方法，该法简便、经济、易行，但用分光光度计测定操作繁杂、费时费力，且由于苯酚-硫酸法中的苯酚易氧化变色等原因，样品久置会影响测定结果。本文首次报道采用酶标仪代替分光光度计，实现测定操作的一步化，使繁杂的操作简单化，比色所需样品量少（每样品仅需200μl），所有比色操作均在一培养板上一次扫描完成，克服了分光光度计比色的上述诸多缺点，是一种值得推广的较好方法。

参考文献：

［1］ 郭朝晖,蒋生祥.中药百合的研究和应用［J］.中医药学报，2004,32(3):27-29.

［2］ 杨林莎，李玉贤，李明丽，等.苯酚-硫酸比色法测定百合多糖的含量［J］.中国中医药信息杂志，2004,11(8):704-705.

［3］ 周静华，汪祖芳，李芬.大理产百合多糖的含量测定［J］.医药产业资讯，2006,3(17):147-148.

［4］ 刘成海，付桂明，涂宗财，等.百合多糖降血糖功能研究［J］.食品科学，2002，23（6）:113-114.

［5］ 苗明三.百合多糖抗氧化作用研究［J］.中药药理与临床，2001,17(2):12-13.

［6］ 王多宁，张小莉,杨颖，等.百合糖对羟自由基的清除作用［J］.陕西中医学院学报，2006,29(4):53-55.