时间：2022-10-20 01:58:04
摘要：试验针对枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]CBF启动子序列顺式作用元件预测结果，设计特异引物并PCR扩增分离了元件顺序缺失片段，与基本表达载体pCAMBIA1391Z连接后转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后，通过双酶切、PCR及测序筛选出R0-7、R3-10、R4-8、R5-10、R6-10、R7-10和R8-10阳性转化子，成功构建了枳CBF启动子缺失表达载体，为枳CBF启动子顺式作用元件功能验证奠定了基础，为启动子核心元件筛选和转基因高效抗寒柑橘育种提供理论依据。
关键词：枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]；抗寒性；CBF启动子；表达载体
中图分类号：S666；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5228-05
Construction of Expression Vector of Trifoliate Orange Driven by CBF Promoter with Partial Deletion
HE Li-gang，JIANG Ying-chun，XU Miao，TONG Zhu，WU Li-ming，WANG Zhi-jing，SUN Zhong-hai
（Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430209， China）
Abstract：The transcription factor CBF known as master switch plays an important role during cold acclimation and responses to low temperature. In this study， the genomic DNA fragments with partial deletion in CBF promoter of trifoliate orange[Poncirus trifoliata（L.） Raf.] were isolated by PCR amplification， and ligated with expression vector pCAMBIA1391Z after column purification followed by double digestion， then transformed into E. coli DH5α. Finally， R0-7、R3-10、R4-8、R5-10、R6-10、R7-10 and R8-10 were selected as positive transformants by double digestion and gene-specific PCR amplification with the plasmid DNAs extracted by alkaline lysis， then verified by nucleotide sequencing. The results are helpful for the further functional characterization of cis-action elements in trifoliate orange CBF promoter and high-efficiency transgenic citrus breeding for cold-resistant varieties.
Key words：citrus[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]；cold resistance；CBF promoter；expression vector
植物抗寒性相关转录因子CBF/DREB1（C-Repeat Binding Factor/Dehydration-Responsive Element Binding protein）属于AP2/ERF（APETALA2/Ethylene-Responsive Element Binding Factor）类型转录因子，模式植物拟南芥中由CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1A、CBF3/DREB1C、CBF4/DREB1D组成蛋白质家族，能够特异结合下游靶基因启动子区CRT/DRE 元件，激活下游一系列冷调节基因COR（Cold-regulated genes）的表达，翻译合成RNA 结合蛋白、糖转运蛋白、去饱和酶、糖代谢相关蛋白、LEA蛋白、KIN蛋白、渗透调节物质合成相关蛋白以及蛋白酶抑制剂等细胞保护物质，从而提高植物的抗寒性，被认为是植物冷驯化过程中基因表达调控网络的“主开关”，因此CBF转录因子在植物低温响应网络中具有重要作用[1-3]。
转基因试验结果表明，抗寒相关基因的超量表达可以有效提高植物的低温耐受性[4]。然而，基因高效表达依赖于适宜的启动子，因此启动子的选择尤为关键。启动子依据其特性可以分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子，其中诱导型启动子具有选择性激活特性，可以调控目标基因的高效表达。目前，柑橘抗寒性相关转录因子CBF基因及其启动子已经被成功克隆，经过生物信息学预测分析发现，枳[Poncirus trifoliata （L.） Raf.]CBF启动子序列中含有多种胁迫相关顺式作用元件，如ABRE、MYB、MYC、LTRE以及Circadian生物钟响应元件等[5]。为了进一步获得枳CBF启动子区核心元件信息，本研究构建了枳CBF启动子元件顺序缺失表达载体，从而为冷诱导活性启动子元件筛选奠定基础，并为转基因高效抗寒柑橘育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
枳来自湖北省农业科学院果树茶叶研究所柑橘试验基地，采集枳健康、幼嫩的叶片于自封样品袋中，标记后置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。
载体构建选用的基本表达载体为pCAMBIA1391Z，具卡那霉素抗性（KanR），携带GUS（β-Glucuronidase）报告基因；遗传转化受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 枳基因组DNA采用改良CTAB法提取[6]。
1.2.2 启动子元件顺序缺失片段的克隆 针对枳CBF启动子序列顺式作用元件预测信息，采取元件顺序缺失方式设计扩增特异引物。为简化操作流程，在综合分析基本表达载体多克隆位点信息、限制性内切酶双酶切条件及保护碱基对酶切活性影响之后，直接在启动子缺失片段扩增引物5′端分别引入PstⅠ（CTGCA|G）和EcoRⅠ（G|AATTC）酶切位点，启动子各缺失片段扩增特异引物序列信息见表1。基因片段克隆PCR扩增采用大连宝生物工程公司的高保真DNA聚合酶，PCR反应体系为：模板DNA 2.0 μL，10×ExTaq PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture （2.5 mmol/L each）4.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，ExTaq DNA 聚合酶0.5 μL，dd H2O补足至50.0 μL。PCR循环参数为：94 ℃ 变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化和回收。
1.2.3 CFB启动子缺失片段与基本表达载体的双酶切及其连接 由于PCR扩增片段中含有PstⅠ和EcoRⅠ酶切位点，故直接采用NEB公司高保真限制性内切酶PstⅠ-HF和EcoRⅠ-HF进行大体系双酶切。双酶切反应体系为：纯化后PCR产物 20.0 μL，10× Buffer 10.0 μL，PstⅠ-HF和EcoRⅠ-HF各3.0 μL，ddH2O补足至100.0 μL，37 ℃恒温培养箱中酶切12～16 h。基本表达载体双酶切反应体系和条件同上。反应完成后，采用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒分别纯化，最后采用40 μL Elution Buffer溶解洗脱，洗脱产物直接用于连接。连接体系为：启动子缺失片段 6.0 μL，表达载体片段 2.0 μL（混匀后45 ℃水浴5 min，完成后置于冰上冷却），10× Buffer（NEB）1.0 μL，T4 DNA Ligase（NEB，400 U/μL）1.0 μL，共10.0 μL，16 ℃连接12～16 h。
1.2.4 大肠杆菌感受态的制备及遗传转化 大肠杆菌感受态的制备采用CaCl2法[7]。大肠杆菌遗传转化采用冻融热激法。在预冷的1.5 mL离心管中依次加入10 μL“1.2.3”中的连接产物和50 μL冰上冻融的E. coli DH5α感受态细胞，轻轻吸打混匀，冰浴30 min。冰浴完成后将离心管置于42 ℃水浴热激90 s，然后快速将离心管转移至冰上，冰镇2～3 min。最后加入400 μL LB液体培养基，37 ℃摇床振荡培养复苏45～60 min。吸取200 μL复苏后的菌液均匀涂布于LB抗性平板（Kan终浓度100 μg/mL）上，37 ℃恒温培养箱中倒置暗培养12～16 h。
1.2.5 阳性转化子的筛选及测序验证 挑取大肠杆菌平板上形状规则、较大的单菌落于5 mL含有100 μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃恒温摇床振荡培养12～16 h，振荡速率200 r/min。采用碱裂解法提取质粒DNA[7]。为了筛选出阳性转化子，采用双酶切进行初选，PCR扩增进行复选，最后采用基因测序进行决选。双酶切反应体系及条件为：质粒DNA 4.0 μL，10×Buffer（NEB） 2.0 μL，Pst Ⅰ-HF和EcoRⅠ-HF各1.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL，37 ℃恒温培养箱中酶切12～16 h。PCR扩增体系及条件为：质粒DNA模板0.5 μL，2×PCR Mixture（BioMed） 10.0 μL，正义引物和反义引物各0.4 μL，无菌甘油1.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL，扩增参数同基因克隆。增殖培养过夜菌液送华大基因研究院进行序列双向测序，测序结果采用Bioedit（Ver. 7.0.5.3）进行序列比对分析。
2 结果与分析
2.1 枳CBF启动子元件顺序缺失基因片段的克隆及回收纯化
通过PCR扩增共获得枳CBF启动子7条启动子缺失片段，分别标记为R0、R3～R8（图1）。其中R0没有缺失顺式作用元件；R3相对于R0缺失了4个MYB、2个MYC以及1个ABRE元件，验证MYB、MYC和ABRE对启动子活性的影响[8]；R4缺失1个LTRE元件，LTRE元件具有冷诱导活性，可能是枳CBF启动子低温响应活性的关键元件；R5与R4比较减少了Circadian元件，前人研究表明拟南芥CBF基因的表达受生物钟的调节，因此Circadian元件在CBF表达调控中可能发挥重要作用[9]；R6和R7用于验证启动子中正向重复序列的功能；R8验证CBF上游转录因子ICE蛋白结合序列IBox对于CBF基因转录过程的调控作用[10]。为了进一步构建启动子元件缺失表达载体，对PCR产物进行了回收纯化，回收片段于-20 ℃保存备用。
2.2 连接后转化子阳性克隆双酶切初步筛选
枳CBF启动子缺失片段与基本表达载体在分别大体系双酶切后，经过过柱纯化分别获得带有黏性末端的目的片段和表达载体片段，进一步连接并遗传转化大肠杆菌。每一启动子缺失片段挑取10个转化子以增殖培养，分别提取质粒DNA进行后期阳性筛选。R0中2、5、7含有目的片段大小片段，可能为阳性质粒，其余以空载为主（图2）；R3中6、10酶切小片段与目的片段大小一致，3产物小片段明显大于目的片段（图3）；R4筛选过程中酶切片段分离较复杂，6、8片段与目的片段大小基本一致，作为候选质粒（图4）；R5双酶切后1、2、4、5、6、9、10大小一致，3片段较小（图5）；R6、R7酶切产物全部表现为阳性（图6、图7）；R8筛选1、2、4、7、9、10号质粒可能为阳性，5号酶切片段较其他片段稍大（图8）。
2.3 双酶切候选阳性质粒的PCR复选及测序决选
为进一步确定质粒是否为阳性，在双酶切初步筛选的基础上，必须以候选阳性质粒DNA为模板通过基因扩增特异引物进行PCR验证，同时扩增GUS片段，以双重验证阳性质粒。PCR验证过程中，R0-2、R0-5、R0-7，R3-6、R3-10，R4-6、R4-8，R5-1、R5-2、R5-4、R5-5、R5-6、R5-9、R5-10，R6-1至R6-10，R7-1至R7-10和R8-1、R8-2、R8-4、R8-7、R8-9、R8-10质粒PCR结果表现阳性，基本可以确定为阳性质粒（图9至图15）。为了完全确定阳性转化子，选取转化子R0-7、R3-10、R4-8、R5-10、R6-10、R7-10、R8-10进行了测序验证。测序结果经过比对分析表明，R0-7、R3-10、R4-8、R5-10、R6-10、R7-10、R8-10均为阳性转化子，至此枳CBF启动子缺失表达载体构建成功。
3 小结与讨论
3.1 常规策略无法获得大肠杆菌转化子可能与EB替代类染料或水质有关
在载体构建过程中，最初采用常规载体构建策略，然而通过多次试验始终无法得到转化子，连接没有成功，初步判断可能原因是DNA回收纯化浓度过低。为了解决这一问题，采取批量回收启动子缺失片段和载体片段后合并样品重新沉淀DNA以获得高浓度样品，重新连接、遗传转化大肠杆菌仍然无法获得转化子，而对照样品布满菌落，说明无法连接不是由于低浓度原因导致，可能与黏性末端丢失有关。在更换高效连接酶和高保真限制性内切酶后仍然没有获得转化菌落。排除以上影响因素，结合经验综合分析以往试验方案和现有试验条件，黏性末端丢失可能与凝胶电泳EB替代染料GelGreen和水质有关，还需进一步的试验验证。
3.2 大肠杆菌阳性率与目的基因序列长度和载体片段DNA纯度有密切关系
在改进试验方案后，成功获得了大肠杆菌转化子，然而转化效率较低，同时阳性效率明显偏低。对阳性转化子进行统计，平均阳性率为55.7%，最低仅为20.0%，小片段转化效率明显高于大片段，说明连接效率与序列长短有密切关系。其次，阳性率可能与连接片段中基本表达载体质粒DNA提取质量有关，启动子缺失片段R1最终测序表明插入序列为大肠杆菌基因组DNA，可能是在基本表达载体质粒DNA提取过程中，部分大肠杆菌基因组DNA与质粒DNA同步沉淀溶解造成DNA污染所致，因此，采用新鲜配制的试剂药品，规范试验操作流程，从而提高质粒DNA提取纯度，可以有效增加载体构建转化子阳性率，大幅提高试验效率。
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