广林九号桉叶精油的抑菌活性研究

摘要：研究了广林九号桉[Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis（Guanglin 9）]叶精油的抑菌活性。利用气相色谱-质谱联用技术分析桉叶精油的化学成分，采用滤纸片法评价其抑菌活性，以平板稀释法测定了精油的最小抑菌浓度。广林九号桉叶精油的主要成分有：1，8-桉叶油素（40.844%）、α-蒎烯（24.221%）、α-松油醇（4.661%）、反式-松香芹醇（3.735%）、龙脑（2.762%）、乙酸α-松油脂（3.592%）和松香芹酮（1.978%）。广林九号桉叶精油对测试的菌种均有良好的抑菌活性，但对细菌和霉菌的抑菌效果有所差异。对金黄色葡萄球菌（Staphylococus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli），黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和橘青霉（Penicillum citrinum）的最小抑菌浓度分别为10、20、20、10、10、5 mL/L。

关键词：广林九号桉[Eucalyptus Urophylla×Eucalyptus Grandis（Guanglin 9）]叶；精油；抑菌活性；最小抑菌浓度

中图分类号：TQ654+.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）21-5193-03

Studies on Antimicrobial Activity of Essential Oil from Leaves of Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis （Guanglin 9）

TIAN Yu-hong1，ZHOU Qi1，PO Jun-hua2，MENG Lu-li1，LI Zi1

（1. Department of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China；

2. Liuzhou Huali Household Products Limited Company， Liuzhou 545006，Guangxi，China）

Abstract： The antimicrobial activity of the essential oil from leaves of Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis （Guanglin 9） was studied. The essential oil was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） method. The antimicrobial activity of oil was evaluated by using filter paper method and the minimum inhibitory concentration（MIC） was determined by plate dilution method. The main components of the essenti-al oil were 1，8-cineole（40.844%）， followed by α-pinene （24.221%）， α-terpineol（4.661%）， α-terpinyl acetate（3.592%）， borneol （2.762%）， trans-pinocarveol （3.735%） and pinocarvone（1.978%）. The results indicated that the essential oil had excellent antimicrobial activity against tested microorganisms. The effects of essential oil on antibacterial and antifungal activities differed obviously. The minimum inhibitory concentrations （MICs） were 10，20，20，10，10 and 5 mL/L for Staphylococus aureus， Bacillus subtilis， Escherichia coli， Aspergillus flavus， Aspergillus niger and Penicillum citrinum， respectively.

Key words： Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis （Guanglin 9）； essential oil； antimicrobial activity； minimum inhibitory concentration

广西是国家速生桉商品林基地的主要区域，广林九号桉[Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis（Guanglin 9）]是广西优质速生桉品种，具有速生、干直、耐寒等优良特性，近几年在广西得到了大范围的推广种植。目前广林九号桉的作用还只是木材，砍伐后剩余的枝叶仅被简单地用做燃料，大量的桉叶精油资源被浪费，影响桉树的综合经济效益的提高。桉叶是中国南方常用的中草药，桉叶油具有抗菌、抗炎、抗氧化和局部麻醉等作用，可用于治疗流行性感冒、上呼吸道感染、肺炎、咳嗽及皮肤疾病[1-4]。目前有关广林九号桉叶精油的生物活性的研究还鲜见报道，本试验对广林九号桉叶精油的抑菌活性进行了研究，为科学开发利用广林九号桉叶提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 广林九号桉叶样品于2011年2月采自广西国营沙塘林场，随机在10～15棵广林九号桉树上采集叶片样品，将样品置于阴凉处风干后备用。

1.1.2 菌种 金黄色葡萄球菌（Staphylococus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli），黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和橘青霉（Penicillum citrinum），由广西工学院生物与化学工程系微生物实验室提供。

1.1.3 仪器 6890GC/5973MS型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦科技公司），LRH-250-Ⅱ型全自动新型生化培养箱（广东省医疗器械厂），SW-CJ-1B型标准型净化工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），DMB5型Motic数码显微镜（麦克奥迪实业有限公司），HZ-9212S型恒温培养振荡器（太仓市科教器材厂），628B-2型立式压力蒸汽消毒器（辽宁省铁岭市医疗器械总厂）。

1.2 方法

1.2.1 广林九号桉叶精油的提取 将风干的桉叶叶片切成1～2 cm2的碎片，称取100 g上述样品置于挥发油提取器中按常规水蒸气蒸馏法提取6 h，静置分层后读取挥发油的体积，所得广林九号桉叶油为具有浓郁特殊嗅味的淡黄绿色油状物。

1.2.2 气相色谱-质谱工作条件

1）气相色谱条件。毛细管色谱柱HP-5MS（30 m ×0.25 mm×0.25 μm）。升温程序为60 ℃保持1 min，以2 ℃/min的升温速度升至170 ℃，再以8 ℃/min的升温速度升至270 ℃，270 ℃保持5 min。载气为高纯氦气。进样口温度280 ℃，检测器温度230 ℃，分流比100∶1。

2）质谱条件。EI电离源，电子能量70 eV，电子倍增器电压1.5 kV， 质量扫描范围33～550 amu，全扫描方式。

1.2.3 广林九号桉叶精油的抑菌活性研究

1）抑菌活性的测定。采用滤纸片法测定广林九号桉叶精油的抑菌活性[5，6]。取吸水力较强且质地均匀的滤纸，用打孔器打成直径6 mm的圆形滤纸片，置洁净干燥的培养皿中，干热灭菌后备用。吸取0.2 mL已稀释到一定浓度的各种菌液（细菌为108 CFU/mL，霉菌为106 CFU/mL），将其均匀地涂布于固体平板培养基表面，细菌为营养琼脂培养基（NA），霉菌为PDA培养基。将一片灭过菌的滤纸片放于含菌平板上，再吸取10 μL广林九号桉叶精油垂直加到滤纸片上。细菌在37 ℃恒温培养24 h，霉菌在28 ℃恒温培养48 h，观察抑菌情况，并测量抑菌圈直径。以常用抗生素（细菌用1.0 mg/mL的阿莫西林溶液，霉菌用0.27 mg/mL的克霉唑溶液）作为阳性对照。每个样品做3个平行样，并重复2次。取试验结果的平均值作为最终结果。

2）最小抑菌浓度的测定。采用平板连续稀释法[7，8]。用经灭菌处理的1% Tween 80 去离子水溶液，将待测精油配成不同浓度的药液。将药液与培养基（细菌为NA培养基，霉菌为PDA培养基）充分混匀后取15 mL加入无菌培养皿中，得到含精油浓度分别为80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500、1.250、0.625 mL/L的培养基。吸取制备好的菌悬液或孢子悬液0.1 mL，将其均匀涂布于上述平板表面，置于一定温度（细菌37 ℃、霉菌28 ℃）下，培养一定时间（细菌培养24 h，霉菌培养48 h）后，观察供试菌的生长情况。以完全没有菌生长的精油浓度作为最小抑菌浓度。以常用抗生素（细菌用阿莫西林，霉菌用克霉唑）作为阳性对照，3次重复。

2 结果与分析

2.1 广林九号桉叶精油化学成分

广林九号桉阴干叶的精油提取率为0.52 mL/100 g。对广林九号桉叶精油进行成分分析，采用计算机对各峰质谱图进行NIST标准谱库检索，根据质谱裂解规律进行核对，参考标准图谱及相关文献确定其化学结构[3，9]。利用峰面积归一法计算各组分的相对百分含量，经鉴定确认了56个化学成分，占总离子流出峰面积的94.378%。广林九号桉叶精油化学成分见表1。由表1可知，广林九号桉叶精油主要成分为1，8-桉叶油素（40.844%）、α-蒎烯（24.221%）、α-松油醇（4.661%）、反式-松香芹醇（3.735%）、乙酸α-松油脂（3.592%）、龙脑（2.762%）、松香芹酮（1.978%）、莰烯（1.164%）、α-龙脑烯醛（1.112%）、葑醇（1.104%）、斯巴醇（1.054%）和蓝桉醇（1.036%）。

2.2 广林九号桉叶精油的抑菌活性

广林九号桉叶精油对供试菌种的抑菌圈直径参见表2。由表2可知，广林九号桉叶精油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黄曲霉、黑曲霉和橘青霉均有较好的抑制作用。精油对上述供试菌抑菌圈的大小依次为16.8、13.0、9.5、9.7、11.7和17.5 mm。

2.3 广林九号桉叶精油的最小抑菌浓度

采用平均连续稀释法测定了广林九号桉叶精油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黄曲霉、黑曲霉和橘青霉的最小抑菌浓度，结果见表3。从表3可以看出，广林九号桉叶精油对细菌和霉菌的抑菌效果有差异。对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌3种细菌的最小抑菌浓度为10～20 mL/L，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最小抑菌浓度为10 mL/L。对黄曲霉、黑曲霉和橘青霉3种霉菌的最小抑菌浓度为5～10 mL/L，精油对橘青霉抑制作用最强，最小抑菌浓度为5 mL/L。

3 小结

广林九号桉叶精油主要成分为1，8-桉叶油素（40.844%）、α-蒎烯（24.221%）、α-松油醇（4.661%）、反式-松香芹醇（3.735%）、乙酸α-松油脂（3.592%）、龙脑（2.762%）、松香芹酮（1.978%）、莰烯（1.164%）、α-龙脑烯醛（1.112%）、葑醇（1.104%）、斯巴醇（1.054%）和蓝桉醇（1.036%）。

抑菌活性研究表明，广林九号桉叶精油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉、黑曲霉和橘青霉均具有抑菌活性，其对霉菌的抑制效果要强于对细菌的抑制效果。广林九号桉叶精油在医药、食品及日化工业具有一定的应用开发潜力。

参考文献：

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