己酮可可碱联合霉酚酸酯对高糖诱导人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白—1和纤维连接蛋白表达的影响

[摘要] 目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞（human mesangial cells，HMCs）单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）及细胞外基质的主要成分（extracellular matrix，ECM）纤维连接蛋白（fibronectin，FN）表达的影响及己酮可可碱（pentoxifylline，PTX）联合霉酚酸酯（mycophenolate，MMF）对上述指标的干预作用。 方法 将培养的HMCs分为8组：正常对照组（NG，5 mmol/L葡萄糖）；高糖组（HG，30 mmol/L葡萄糖）；甘露醇渗透压对照组（Man，5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇）；高糖+PTX-0.03组（P1，30 mmol/L葡萄糖+0.03 mg/mL PTX）；高糖+PTX-0.3组（P2，30 mmol/L葡萄糖+0.3 mg/mL PTX）；高糖+MMF-10组（M1，30 mmol/L葡萄糖+10 μg/mL MMF）；高糖+MMF-100组（M2，30 mmol/L 葡萄糖+100 μg/mL MMF）；高糖+PTX+MMF组（P+M，30 mmol/L葡萄糖+0.3 mg/mL PTX+100 μg/mL MMF），分别在24、48、72 h采用RT-PCR法和ELISA法检测PTX、MMF及PTX+MMF对高糖条件下MCs内MCP-1 mRNA及蛋白、FN表达的影响。 结果 高糖组HMCs MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌较正常对照组显著增加（P < 0.01），且48 h表达最高；不同浓度的PTX、MMF均能下调MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达（P < 0.01）；不同浓度的MMF对MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN分泌的抑制程度不同，呈时间剂量依赖性（P < 0.05）；不同浓度的PTX则随着时间的延长对其抑制作用无明显差别；PTX联合MMF组比单独PTX各组在各时间点的抑制程度更明显（P < 0.01），比单独MMF各组在各时间点抑制作用增强，（24 h，P < 0.05），但随着时间延长，差异无统计学意义。 结论 PTX及MMF可能通过阻抑MCP-1的表达及FN的分泌延缓糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）中肾小球硬化及间质纤维化的进展，联合给药组作用优于单药，可能从改善血流动力及抗炎角度解释了PTX联合MMF对DN肾脏的协同保护作用。

[关键词] 糖尿病肾病；单核细胞趋化蛋白-1；己酮可可碱；霉酚酸酯；纤维连接蛋白

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（c）-0012-05

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常见和最严重的慢性并发症之一，多种病理机制参与其发病过程，但目前确切的发病机制尚未完全明了。除了血糖、血脂代谢紊乱、血流动力学异常、血管活性物质参与等因素外，近年来许多实验和临床资料均提示糖尿病肾病往往存在炎症细胞浸润和细胞因子、炎症介质水平上升，为抗炎治疗在糖尿病肾病中的应用提供了理论基础[1-2]。研究证明己酮可可碱（pentoxifylline，PTX）能抑制白细胞黏附与聚集，降低血小板和粒细胞的高反应性，有效改善高凝状态。免疫抑制剂霉酚酸酯（mycophenolate，MMF）对实验性DN有一定改善作用，其机制为抑制肾内炎症细胞浸润。本研究应用PTX联合MMF，观察其对实验性DN是否具有协同保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

正常人肾小球系膜细胞（human mesangial cells，HMCs）株（编号4200），系膜细胞完全培养基MCM（4201）（美国Sciencell公司），改良型RPMI-1640培养基和0.25%胰蛋白酶（美国Sigma公司），无噬菌体低毒素胎牛血清（杭州四季青），RNA提取液TRIzol（美国Invitrogen 公司），引物、GAPDH、marker及RT-PCR（大连宝生物），ELISA试剂盒（上海森雄），PTX（美国Sigma公司），MMF（深圳虹彩祥根）。

1.2 方法

1.2.1 HMCs培养及分组 MCM 4201完全培养基常规培养HMCs，置于37℃，饱和湿度5%二氧化碳（CO2）的培养箱内贴壁传代培养，每2天换液1次，3～4 d传代1次，取6～9代对数生长期细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔培养板中，每组设3个复孔（n=3），培养细胞待其贴壁融合70%～80%后用无血清培养基同步化24 h，用于不同环境下继续培养。HMCs共分8组：正常对照组（NG，5 mmol/L葡萄糖）；高糖组（HG，30mmol/L葡萄糖，这一浓度是体外实验模拟体内高糖环境的最佳适宜浓度[3-4]），甘露醇渗透压对照组（Man，5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇）；高糖+PTX-0.03组（P1，30 mmol/L葡萄糖+0.03 mg/mL PTX）；高糖+PTX-0.3组（P2，30 mmol/L葡萄糖+0.3 mg/mL PTX）；高糖+MMF-10组（M1，30 mmol/L葡萄糖+10 μg/mL MMF）；高糖+MMF-100组（M2，30 mmol/L葡萄糖+100 μg/mL MMF）；高糖+PTX+MMF组（P+M，30 mmol/L葡萄糖+0.3 mg/mL PTX+100 μg/mL MMF），继续培养，收集上清及细胞。

1.2.2 细胞总RNA的提取和检测 按“1.2.1”项下实验分组及TRIzol试剂产品说明提取24、48、72 h的细胞总RNA。提取的RNA用紫外分光光度仪测定其纯度和含量。

1.2.3 逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR） 反转录成cDNA进行RT-PCR，按说明书配制成25 μL反应体系，上下游引物均由大连宝生物工程有限公司（Takara）设计合成（表1），反应条件如下：预变性：94℃，5 min；变性：94℃，30 s；退火：62.2℃，30 s；延伸：72℃，2 min，共32个循环，最后72℃延伸10 min。反应结束后行产物的溶解曲线分析，以GAPDH为内参行结果分析。

1.2.4 ELISA法检测细胞上清液中单核细胞趋化蛋白-1 （monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）蛋白含量 取不同处理因素作用24、48、72 h的细胞上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用SNK-q法检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMCs中MCP-1 mRNA的表达

HMCs经高糖培养后，MCP-1 mRNA表达在各时间点均增加，48 h作用最明显，差异均有统计学意义（P < 0.01）；各个时间点甘露醇渗透压对照组与正常对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）；各处理组与高糖组相比，MCP-1 mRNA表达量均显著减少，且差异有统计学意义（P < 0.01）；10、100 μg/mL MMF处理组在不同时间点上吸光度值分别为24 h：（0.8271±0.0432）、（0.7656±0.0778），48 h：（0.9625±0.0291）、（0.7768±0.0336），72 h：（0.7642±0.0431）、（0.6873±0.0192），呈时间剂量依赖性（P < 0.05）；PTX各组不同时间点的吸光度值分别为24 h：（1.0188±0.0945）、（0.9092±0.0195），48 h：（1.1239±0.0288）、（1.0725±0.0349），72 h：（0.8593±0.0116）、（0.8348±0.0065），表明PTX虽随着浓度的增加，抑制作用也逐渐加强（24 h，P < 0.05），但随着时间延长，差异无统计学意义（P > 0.05）；PTX联合MMF组各时间点吸光度值分别为（0.6258±0.0305）、（0.7433±0.0495）、（0.6211±0.0142），比单独PTX各组在各时间点的抑制程度更明显（P < 0.01），比单独MMF各组在各时间点抑制作用增强（24 h，P < 0.05），但随着时间延长，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1～4。

2.2 ELISA法检测不同分组培养的HMCs上清液中MCP-1、FN各蛋白在各个时间点表达量的变化

HMCs经高糖培养后，上清液中MCP-1、FN表达在各时间点均增加，48 h作用最明显，差异均有统计学意义（P < 0.01）；各个时间点甘露醇渗透压对照组与正常对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）；各处理组与高糖组相比，MCP-1、FN分泌量均显著减少，且有统计学差异（P < 0.01）；MMF处理组有一定的浓度依赖性（48、72 h，P < 0.05）； PTX虽随着浓度的增加，抑制作用也逐渐加强，（24 h，P < 0.05），但随着时间延长，差异无统计学意义（P > 0.05）；PTX联合MMF组比单独PTX各组在各时间点的抑制程度更明显（P < 0.01），比单独MMF各组在各时间点抑制作用增强（24 h，P < 0.05），但随着时间延长，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2、3。

3讨论

DN作为DM的主要微血管并发症，是DM致死致残的重要原因，其病理改变为肾小球肥大，间质纤维化，细胞外基质聚集及基底膜增厚。DN的发病率在逐年上升，其发病机制复杂，至今尚未明了。目前认为其发生是多种因素共同作用的结果，如肾小球血流动力学改变、糖脂代谢异常、遗传易感性及炎症因子的作用等。

近些年的研究表明，炎症在DN发生发展中所起的作用受到越来越多的关注。其中肾脏被单核或巨噬细胞浸润是其标志之一，MCP-1参与单核或巨噬细胞浸润，在DN的发生发展中起重要作用。在DN中，单核或巨噬细胞可以通过释放蛋白水解酶和氧活性物质导致肾小球结构损伤，并可释放改变肾小球功能的细胞因子而致其结构重塑[5]，参与了肾小球的损伤。MCP-1的主要功能是根据其浓度梯度聚集单核细胞到动脉硬化损伤处，并促进单核细胞转化成巨噬细胞。反过来，这些巨噬细胞产生促炎症细胞因子，在动脉壁内产生局部慢性炎症，从而加重肾小球动脉硬化的发展。除了引起肾小球损害外，MCP-1还可以通过单核/巨噬细胞到肾小管间质介导肾脏间质炎症、肾小管萎缩和间质纤维化而加重DN的发展[6]。另一面，某些细胞外基质 （extracellular matrix，ECM）成分，特别是FN能够促进细胞黏附和移动，而FN主要通过整合素家族发挥作用，因此细胞外基质蛋白的增多是肾小球硬化发生发展的重要因素，在DM患者和DM动物模型中，肾小球中FN的表达均显著增加[7]。

系膜细胞（Mesangial cells，MCs）是肾小球内非常活跃的细胞，具有分泌ECM、产生细胞因子、吞噬和清除大分子物质的功能，在正常情况下，MCs不发生异常增殖活动，它在维持肾小球结构和功能的稳定性上起重要作用。但DN时，MCs是高血糖等致病因子作用的主要靶细胞，可见MCs异常增生，肾小球内ECM增加或降解减少，造成ECM成分的大量堆积，这些作用直接导致肾小球结构病理性重构，从而介导肾小球肥大、硬化。而且在DN中系膜细胞的增殖可以通过增加转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达加速肾小球损伤的进展，并随着病程的不断延长，循环往复，肾脏损伤进行性加剧[8]。因此研究它在高糖作用下生物学活性的改变，对探讨DN的发病机制具有重要意义。

本研究通过体外培养HMCs证明了高糖能够上调MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达，这与以往的研究结果一致[9-10]。MCP-1及FN被上调后，参与肾小球硬化及间质纤维化的过程，从而导致DN发生发展。本实验提示高糖诱导下的HMCs 中炎症因子MCP-1及细胞外基质成分FN的表达显著升高，并进一步加速HMCs的增殖、炎症反应和纤维化，从而可能导致肾小球硬化的发生和发展。其高峰表达在48 h，而72 h则呈下降趋势，可能是由于HMCs长期暴露于高糖环境中，高糖对HMCs产生代谢毒性作用，进而诱导部分HMCs凋亡，从而使得MCP-1 mRNA和蛋白的表达及FN分泌减少。甘露醇渗透压对照组和正常对照组比较，对MCP-1表达及FN分泌无明显差异，提示高糖对HMCs的影响与渗透压的改变无关。我们的研究还发现在正常糖培养下的HMCs中MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达在48 h内，随着培养时间的延长也有所增加，但没有统计学意义，可能与HMCs培养时间的增加，细胞不断分裂增殖有关；而48 h后上述指标的表达则减少，可能与细胞凋亡、且凋亡速率大于细胞增殖速率有关。

PTX为甲基黄嘌呤衍生物，它可以提高红细胞内ATP等物质，改善受损红细胞和白细胞的变形能力，增加纤溶性，从而改善微循环、降低血黏度、抑制血小板聚集、增加周围微循环和组织携氧能力。同时还能抑制磷酸二酯酶活性起到扩张血管作用，从而增加脑、肌肉、肝脏、肾脏等器官的血流量，改善机体营养性微循环及缺血区的氧供应。有研究表明PTX能抑制高糖诱导的MCs增殖，并下调结缔组织生长因子表达，减少ECM积聚，延缓DN[11]。同时PTX尚能增强激素和免疫抑制剂的有效作用，减少其毒性。

MMF是霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）的2-乙基酯类衍生物，作为一种新型的免疫抑制剂，最初广泛应用于器官移植后的排斥反应，主要药理作用是抑制淋巴细胞与单核细胞增殖，减少抗体的产生，抑制细胞表面黏附分子的合成，从而发挥抗炎作用。但最近有研究表明MMF对血管平滑肌细胞的增殖，细胞因子的表达如TGF-β、MCP-1、组织型金属蛋白酶抑制剂-1和ECM的聚集有一定的抑制作用。在DN中，MMF的抗炎作用进一步得到证实。Zhang等[12]通过对糖尿病大鼠MMF的干预，发现其能阻止足细胞的丧失而减少尿蛋白排泄率，机制可能为MMF能减少肾小球中MCP-1的表达，增加去氧肾上腺的分泌。学者们进一步研究发现，MMF是通过降低DN中核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活性及下调MCP-1等炎症因子的表达来减少单核/巨噬细胞在肾组织中的浸润，从而使肾脏得到有效保护[13]。

本实验得出PTX及MMF能明显抑制高糖培养下MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌，病程初期联合用药疗效优于单药，这与既往的报道PTX能减少肾脏MCP-1的分泌，减轻肾小球系膜细胞基质增多，基底膜增厚及MMF能下调MCP-1 mRNA、蛋白表达的结果一致，不过本研究通过不同浓度PTX及MMF的比较，发现发现低浓度MMF（10 μg/mL）就有显著抑制高糖培养下MCP-1 mRNA和蛋白表达，同时能抑制FN分泌，且随着MMF浓度成倍增加（100 μg/mL）及作用时间的延长，抑制作用明显加强，MMF减少MCP-1 mRNA和蛋白表达及FN分泌呈时间剂量依赖性。而不同浓度的PTX虽然都能抑制上述指标的表达，且随着浓度的成倍增加，其抑制MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达也逐渐加强，但在48、72 h作用点上差异却无统计学意义，表明随着时间延长，血流动力不以PTX剂量依赖方式得到进一步改善。

本实验通过联合PTX及MMF，发现其抑制MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌作用明显强于PTX组，在24 h作用点上，明显强于MMF组，但随着时间时间延长，联合组与MMF组差异无统计学意义，这提示抗炎贯穿整个病程的始终，而改善血流动力在初期有效，随着病程延长，微循环障碍的加重，效果不显著。

总之，PTX及MMF均能抑制高糖诱导的HMCs中MCP-1 mRNA及蛋白的表达，减少HMCs分泌FN，在病程初期联合给药组作用优于单药，提示两者均能阻抑MCP-1 mRNA及蛋白表达减少ECM积聚，延缓DN进展，而联合给药组在病程初期对肾脏具有协同保护作用，这为尽早改善血流动力及积极抗炎提供了理论依据。

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（收稿日期：2013-05-14 本文编辑：卫 轲）