葫芦科蔬菜未受房离体培养的研究进展

摘 要：阐述了葫芦科作物未受房离体培养的影响因素及再生植株的倍性鉴定和染色体加倍的方法，提出了未受房离体培养存在和需要解决的问题，从理论和实际意义上说明葫芦科蔬菜未受房离体培养的发展前景。

关键词：葫芦科蔬菜；未受房；离体培养；单倍体；影响因素；倍性鉴定

中图分类号：S336 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2013）10-0007-04

葫芦科作物包括黄瓜、南瓜、西瓜、西葫芦等常见的蔬菜和瓜果，是世界上重要的食用植物科之一，其重要性仅次于禾本科、豆科和茄科作物。长期以来，西瓜常规育种周期长、工作量大、遗传性状不稳定等因素在很大程度上限制了西瓜的育种进程。单倍体经自然或者人工加倍可得到纯合二倍体，这对异花授粉作物和杂交后代来说意义非常重大。一方面，单倍体育种大大缩短了二倍体的纯合时间，从而减少了育种年限；另一方面还能克服远缘杂交不亲和，提高诱变育种效率以及合成育种新材料。但是，葫芦科作物自发产生单倍体的频率极低，不能满足育种工作的需要，所以研究者尝试通过雄核和雌核离体培养两个途径来诱导单倍体。目前葫芦科作物通过雄核离体培养生产单倍体难度较大，采用雌核离体培养（未授粉的胚珠或子房）来获得单倍体植株，是在较短时间内获得高度纯合二倍体快速且有效的方法。到目前为止，通过未授粉子房或胚珠离体培养在葫芦科的黄瓜、甜瓜、南瓜、苦瓜、西葫芦上已成功获得了单倍体植株，这对于葫芦科作物的育种有着十分重要的意义[1]。

1 未受房离体培养的国内外研究进展

未受房离体培养的目的就是为了得到单倍体植株，自1921年意大利植物学家Blakesly在自然界中发现曼陀罗的单倍体植株以来，许多研究者都想利用单倍体加倍获得纯系，从而达到迅速稳定杂种的目的。未授粉子房的离体培养是获得单倍体植株的有效途径之一。20世纪50年代末就开始有人离体培养未授粉的子房，并试图通过此途径诱导单倍体，但是都没有成功。直到1976年，San Noeum[2]首次报道在小麦未受房离体培养试验中获得单倍体植株。此后，国外的育种工作者一直在研究单倍体育种并试图完善其途径，已经在许多植物种类上成功得到单倍体并应用于新品种的培育。国内从20世纪70年代才开始进行这方面的工作，直到80年代，我国的雌核离体培养研究出现了第一个高峰，并在水稻、小麦、大麦、玉米、烟草等作物上，获得了单倍体及自然加倍的双单倍体植株。在葫芦科上，杜胜利[3]成功地在黄瓜未受房的离体培养研究上得到了单倍体植株，并已将研究应用到黄瓜的新品种选育上。Gémesné等[4]利用未授粉子房离体培养成功获得了单倍体植株。Ficcadenti 等[5]运用与Gémesné等相似的培养方法在甜瓜未受房离体培养中也获得了单倍体植株。2009年，葛志东[6]在西葫芦未受房的培养中也同样得到了再生单倍体植株。迄今为止，虽然未受房的离体培养在一些植物中已获得单倍体植株，但仍然有多种作物没有突破，这一途径也存在着许多问题，为了更好地将相关的研究成果应用到育种工作中，应进行进一步深入研究。

2 影响西瓜未受房离体培养的主要因素

葫芦科未授粉子房离体培养诱导单倍体的影响因素很多，主要有供体植株的基因型、胚囊的发育时期、供体的生长季节、外植体的预处理和预培养、培养基及激素的添加和培养条件等。

2.1 基因型

供体植株的基因型是影响未受房胚胎发生的重要因素之一已被广泛证实，有些植株的子房只对特定的培养基有反应[7]。杜胜利[3]以生长在同一春大棚中的津春3号和津杂2号黄瓜品种为试材，同期取未受房在培养基上进行离体培养，发现津春3号的胚芽和愈伤诱导率均高于津杂2号。同样裴晓利等[8]将9种不同基因型黄瓜的子房切片接种到诱导培养基上，得出各材料单倍体诱导率变化幅度为65.52%～93.33%。这可能因不同材料的未受房对离体培养的敏感度不同，因此，选择合适的基因型是植物未授粉子房离体培养成功的关键。

2.2 胚囊发育时期

胚囊发育时期对胚状体的诱导至关重要。许多研究表明，处于成熟胚囊期即开花当天的未受房，其胚状体诱导率、成苗率均最高[9，10]。这可能是花器内源激素的水平在开花当日达到较高水平的缘故。但在黄瓜试验中发现，开花前1～4 d的子房均可诱导获得胚芽，但以开花前2～3 d的子房胚芽诱导率最高[11，12]；同样，葛志东[6]和孙守如等[13]发现，开花前1 d的西葫芦子房和胚珠已成熟或接近成熟，易于被诱导。故不能仅凭开花时间来判断胚囊发育时期，因为胚囊发育会因植株生长状况及采花时期不同而不同，开花天数相同胚囊发育时期也不尽相同。

2.3 供体的生长季节

供体材料的生长季节对胚状体的诱导有一定的影响，不同播期的材料其胚状体发生频率差异极显著。盛慧[14]的试验表明，秋季生长的黄瓜材料诱导率要高于春季，且不易污染，冬季的诱导效果一般。同样陈解放[9]在南瓜上也得出胚状体发生和小苗的诱导集中在 7 月中旬和 8 月中旬。Przyborowski等[15]也在黄瓜单倍体诱导中发现，春季材料的诱导率很低，仅是夏季材料诱导率的 1/4。说明季节对未受房离体培养的影响是显著的。

2.4 外植体的预处理和预培养

未受房接种之前采用适当的方法进行预处理，或在接种后进行适当的预培养能够提高其培养效果。

①低温预处理 周林[16]将2个供试材料置于4℃低温预处理24～96 h，发现预处理72 h效果最好，2个材料诱导率分别达到了49.34%和60.57%。王文和[17]在试验中得出，4℃低温处理2 d草莓离体诱导效果最佳，随着时间延长诱导率缓慢下降。但是Gémesné等[4]发现，低温预处理对黄瓜未受房的诱导效果不明显，虽然低温预处理广泛用于葫芦科、十字花科等作物的大孢子培养，但其作用机理仍无具体定论。

②高温预培养 高温预培养对于启动雌核发育有相当重要的作用，在有些材料上不进行预培养就不能形成胚状体[4]。徐静[7]、郭永强[12]在试验中发现，35℃黑暗热激5 d对启动西葫芦雌核发育有积极的作用，胚珠转绿的百分率可达90.5%。同样，Gémesné等[4]在黄瓜上也发现经过35℃热激处理效果最好，诱导率达18.4%。这可能与子房在热激前后的生理性状不同有关。

2.5 培养基

培养基是雌核诱导单倍体过程中的重要影响因素，培养基的影响涉及到基本培养基的种类、碳源的种类及浓度、外源激素的种类及浓度等诸因素。

①基本培养基 目前未受房的离体培养多采用MS基本培养基或其改良型。韩丽华[18]在厚皮甜瓜试验中选用MS培养基获得了单倍体植株。杜胜利[3]则选用了1/2 MS培养基对黄瓜未受房进行培养，并成功获得了单倍体植株。然而，Kantartzi等[19]在研究中发现基本培养基H 和MS没有明显的区别。那么究竟用何种培养基，必须经过充分的比较试验才能确定，很难一概而论。

②培养基中的添加物 a.激素。基本培养基只有配合使用适当的外源激素，才能更好地诱导愈伤组织、胚状体的形成以及芽、根的分化。有研究表明，培养基中不加任何外源激素不能诱导子房的膨大和雌核发育[20]。葛志东[6]以西葫芦为对象研究了激素对未授粉子房离体培养的影响，结果表明，NAA、6-BA 和 2，4-D是诱导雌核发育的3种理想的外源激素，以3 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L NAA+

1 mg/L 6-BA的组合诱导效果最好。Li等[21]认为在基础培养基中加入0.03～0.07 mg/L的TDZ效果最佳，胚珠诱导率高达7.85%～12.14%。杜胜利[3]在黄瓜试验中也得出，在仅加细胞分裂素不加生长素的培养基上可以诱导出更多正常的胚芽。所以在试验中我们应该根据需要来选择合适的激素及激素浓度。

b.活性炭。活性炭能吸附培养基中的有害物质，给胚珠和子房创造更好的发育环境。Van等[22]和Gürel等[23]在试验中发现培养基中未添加活性炭的甜菜诱导率很低。而周林[16]在西瓜试验中得到了相反的结果。这可能因为活性炭的吸附没有选择性，在吸附培养基中的有害物质的同时也吸附了一些大量、微量元素和其他有用成分。所以在实际操作中应该严格控制活性炭使用量。

c.碳源。碳源不仅能给外植体提供能量，而且也能维持一定的渗透压。许多研究表明，3%～4%的蔗糖浓度适合未授粉子房的诱导[7]。在添加了40 g/L蔗糖的培养基中，西瓜未受房愈伤组织诱导率最高，分别达到了47.34%和53.14%[16]。杜胜利[3]在蔗糖对黄瓜雌核发育影响的试验中发现，在30 g/L蔗糖条件下效果最好。

d.AgNO3。韩丽华[18]首次将AgNO3应用于厚皮甜瓜雌核离体诱导，发现AgNO3浓度为80 mg/L时，胚状体诱导率最高，为0.74%。裴晓利等[8]发现在诱导培养基中添加AgNO3能显著提高黄瓜雌核发育启动率。

2.6 培养条件

许多试验表明，培养温度白天28℃左右，夜间25℃左右，光照强度1 500～2 000 lx，每天光照16 h诱导率最高[16，23]。同样杨颖[24]在西瓜上发现25℃暗培养4 d后再进行光暗交替培养效果最佳。而王璐等[25]在黄瓜试验中发现，经过25℃暗培养处理1 d，启动雌核发育的反应率最高，达91.3%。总之，各种培养条件对不同植物的离体雌核发育有着不同的影响，但在葫芦科方面，大部分研究证明，前期暗培养约一周，后期采取恒光恒温的培养方式效果最佳。

3 再生植株倍性鉴定及染色体加倍

3.1 再生植株的倍性鉴定

葫芦科作物通过单倍体诱导获得的再生植株，往往是既有单倍体也有双单倍体，甚至还有混倍体的，因此有效的倍性鉴定是其进一步应用于育种的基础。目前鉴定植株倍性的方法主要有：形态学鉴定法、染色体计数法、流式细胞仪鉴定法、气孔保卫细胞鉴定法。

①形态学鉴定法 因单倍体植株在正常生长状态下常比其二倍体弱小，所以利用形态学特征在幼苗期可以目测选出大部分单倍体。这种方法比较直观、便捷，但是耗时长。

②染色体计数法 是确定植物染色体倍性最基本和最精确的一种方法，通常以根尖或子房为材料，通过显微镜观察染色体数目来确定植株倍性。

③流式细胞仪鉴定法 是用特异的DNA荧光染料对细胞染色，然后测定样品的荧光密度，荧光密度与DNA含量呈正比。这种方法快速、简便、准确，但是价格昂贵。杨颖[24]在西瓜未受房的离体培养的试验中利用流式细胞仪鉴定了再生植株的倍性。Gémesné等[4]在黄瓜研究中也利用流式细胞仪检测到87.7%的再生植株为单倍体。

④气孔保卫细胞鉴定法 是依据气孔保卫细胞的长度、叶绿体数目、单位面积内的气孔数目等的不同进行植株倍性鉴定。谢冰等[26]选用此方法初步确定了西葫芦植株的倍性。

3.2 染色体加倍

单倍体植株只有加倍成纯合的二倍体才能在实际育种中应用。单倍体植株在生长发育过程中，可以自然加倍成双单倍体，但是频率一般比较低，而且加倍频率受试材基因型的影响，所以需要采用人工加倍方法来满足育种实践的要求。到目前为止，大多数试验是利用秋水仙碱诱导单倍体。秋水仙碱处理方法有：浸渍法、涂抹法、滴液法等，其中浸渍法是主要的方法。杜胜利[3]采用秋水仙碱浸泡处理黄瓜植株后，其成活率大大提高，且变异率达33.3%和41.7%，加倍率为4.1%。

4 问题及展望

4.1 存在的问题

通过未受房的离体培养诱导单倍体在很多物种中已得到应用，但这种方法还不能普遍应用在所有重要栽培作物中。特别是在西瓜未受房离体培养上，诱导体系还不完善，诱导率也不高。即使成功诱导出单倍体植株，也存在如何将诱导率稳定下来，如何选择最好的再生植株倍性鉴定方法及胚囊植株加倍方法等问题，所以还需要进行大量的试验研究。

4.2 展望

通过未受房的离体培养获得单倍体，避免了育种工作中繁琐的多代自交程序，能够快速有效地获得纯合双单倍体，并且可直接应用于培育新品种或作为优良亲本应用于品种改良，从而大大缩短育种年限；通过单倍体加倍可得到高度纯合的双单倍体，被认为是研究分子标记和基因图谱的极好材料。同时在单倍体和双单倍体中，所有隐性基因均处于纯合状态，可消除显性基因的干扰。因此，西瓜未受房的离体培养技术在作物遗传育种的理论和实践研究中均具有广阔的应用前景。相信在不久的将来，西瓜未受房的离体培养技术能够逐步完善，能为遗传育种做出巨大贡献。

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