葫芦科植物未授粉子房培育单倍体研究进展

摘 要：综述了近年来葫芦科植物未授粉子房培养单倍体状况，及葫芦科植物未授粉子房培养的取材、基因型、温度、激素等几个因素影响的研究进展，进而对其当前问题及前景进行了探讨。

关键词：葫芦科；未授粉子房；单倍体

染色体加倍能快速纯化单倍体植株育种材料，缩短育种年限，且使单倍体材料能在当代即表现出显隐性基因型性状，在育种方面发挥着重要作用，在遗传学研究及基因图谱构建等方面也具有重要的意义。葫芦科（Cucurbitaceae）植物分布在中国的有130多个种，其中甜瓜、黄瓜、南瓜、葫芦、西瓜等都具有很高的经济价值，其品种改良具有极大潜力。在自然界中葫芦科植物自发产生单倍体的频率极低[1]，而长期的研究结果表明，通过花药和小孢子培养在葫芦科植物中得到单倍体的几率很小，但通过葫芦科植物雌核发育（gynogenesis）途径进行单倍体研究是一条重要途径。雌核发育是指离体条件下由未授粉胚囊产生单倍体胚和植株的过程[2]。雌核发育培育单倍体主要有2种方式：一种是让入卵后，保证精核不与卵核融合而退化，刺激卵核分裂发育为胚，这种方式主要通过辐射处理花粉授粉后将雌核离体培养；另一种是对未授粉子房或胚珠进行离体培养，诱导雌核发育。本文着重对未授粉子房培养研究状况及影响因素作出简要概述。

1 葫芦科植物雌花未授粉胚珠离体培养单倍体研究概况

未授粉胚珠离体培养是一种简单有效的加速植物快速纯化的方法，而且为研究孤雌生殖或无配子生殖的细胞胚胎学提供稳定的实验体系。

1985年，Chamboner等[3]首次在西葫芦中采用未授粉胚珠离体培养技术获得单倍体和二倍体的植株。Metwally等[4，5]对西葫芦品种Eskandarani开花前1 d的雌花，通过低温诱导和含不同浓度2，4-D的MS培养基进行培养，成功获得了西葫芦单倍体植株。随后国内学者陈学军等[6]、谢冰等[7]分别在西葫芦中得到胚囊植株并驯化成功。刘栓桃等[8]利用9个不同基因型的西葫芦材料，研究了激素、取样时间和基因型3个因素对西葫芦未授粉胚珠离体培养的影响。南瓜子房未授粉子房培养试验1988年获得初始成功[9]。Shalaby[10]在Metwally等[4]的基础上采用1 mg/L 2，4-D和Kinetin培养基对基因型、雌花位置、温度和蔗糖浓度4个因素进行研究并获得了南瓜单倍体植株。

黄瓜的未授粉子房离体培养研究始于1996年，但起始效果不佳[11]。Gémes等[12]将黄瓜子房放置于诱导培养基上，在不同温度下热激并暗处理2～5 d，随后转移到再生培养基进行培养。结果表明，热激处理通过优化雌配偶体发育提高雌核再生频率。并通过组织观察发现雌性配子体的单倍体诱导的最佳时期为胚囊形成阶段。国内随后也对黄瓜基因型、取样时期、激素及处理温度对胚状体的诱导进行了探讨[13～16]，并获得了纯合的黄瓜材料。

Ficcadenti等[17]首次在甜瓜中采用未授粉胚珠离体培养技术，其选择了2个常规材料和1个F1代杂交种进行培养并获得再生胚。随后 Lotfi等[18]也对甜瓜进行了未授粉胚珠离体培养。Malik等[19]对不同温度和几种不同激素对甜瓜未授粉子房培养效果进行研究，采用SSR分析证实获得的双单倍体植株为纯合双单倍体，并通过SSR标记证实这些获得的双单倍体为纯合的雌配子的再生胚。

以上这些研究结果表明，未授粉子房培养技术在葫芦科植物育种及科学研究中的重要地位受到越来越多研究者的重视。而其复杂的影响因素对建立高效稳定的技术体系有着严重阻碍，因此探讨其最佳的培养条件对该项技术的应用有着重要意义。以下对其影响因素相关研究进展进行概述。

2 未授粉葫芦科植物胚胎发生影响因素

2.1 取材状况

许多研究结果表明，试验材料的播种时期、雌花的发育时期及雌花的部位等对胚胎离体培养中的胚诱导频率都有着重要的影响。陈学军等[6]通过对西葫芦开花前3 d，当日和开花后2 d未授粉子房分别进行培养，结果显示诱导率分别为10.5%，14.2%和4.4%，表明开花当日子房离体培养效率最高。谢冰等[7]通过西葫芦不同开花时期取材试验证实开花前1 d和开花当日胚珠诱导频率最高，秋播材料诱导频率较夏播和春播的高。Shalaby[10]对2个南瓜Giad和Raad的F1代的第一节雌花、第二节雌花和第三节雌花分别进行未授粉胚珠离体培养研究后发现，第二节雌花胚诱导和成苗效果最佳。刘栓桃等[8]对9种基因型西葫芦材料进行不同开花时期取材试验，结果显示，除1个材料没能得到再生植株外，其他均表现为开花当天的胚珠最适合诱导培养，再生植株产率表现最高。

2.2 基因型

Ficcadenti等[17]对2个甜瓜品种（reticulatus， inodorus）及其杂交种进行了未授粉雌花子房培养，结果显示，reticulatus出胚率最高。Shalaby[10]对12种不同基因型南瓜品种的未授粉雌花子房培养发现，Raad F1代材料表现最佳，胚诱导率为48.4%，每皿成苗15株。刘栓桃等[8]对9个不同基因型西葫芦材料的未授粉胚珠诱导培养发现，再生植株产率最高的能达到33.33%，而最低的仅为2.67%。陈小鹏等[14]对3个黄瓜品种未授粉子房的胚状体诱导试验结果表明，黄瓜基因型对雌核发育也有着重要影响。以上这些结果表明，基因型在甜瓜、南瓜、西葫芦等葫芦科植物的雌核发育中有着重要作用。

2.3 温度预处理

温度处理极有可能促进雌核发育由正常配子发育（gametophytic development）转换成腐生途径（saprophytic pathway），从而导致单倍体胚形成[10]。Kwack等[9]研究表明，南瓜在5℃条件下预处理2 d能提高胚胎的发生几率。Gémes等[12]将黄瓜子房放置于诱导培养基（induction media containing thidiazuron）上，分别在24，28，35℃环境下暗处理2～5 d；随后转移到再生培养基（regeneration media α-naphthaleneacetic acid and 6-benzylaminopurine），结果表明，热激处理通过优化雌配偶体发育提高雌

核再生频率。其中35℃胚胎再生效果最好，其胚胎发生频率为18.4%，植株再生频率为7.1%。Shalaby [10]将南瓜Queen F1代分别放置在4℃和32℃下预处理0，4，7，12 d，结果显示，4℃或32℃条件下都是

4 d的处理效果最佳。Diao等[16]对黄瓜的研究结果也表明，在35℃条件下热激3 d的效果较2 d和4 d的好。

此外在对葫芦科植物子房进行温度刺激预处理的试验中，也有些结果表明，热激或冷激处理对雌核诱导成单倍体有副作用。Yang 等[20] 的研究结果表明，许多物种中冷激处理对雌核培养具有副作用。Metwally等[4]通过将开花前1 d的西葫芦（Eskandarani）在4℃分别进行2，4，8 d预处理，结果发现不进行预处理的的材料具有最高的胚诱

导率。

2.4 激素处理

Kwack 等[9]研究认为，植物激素对南瓜的胚发生有着重要作用。Metwally等[4]在诱导西葫芦未授粉胚胎分化时分别使用浓度为0.1，1，5，10 mg/L的 2，4-D，结果发现1 mg/L和5 mg/L 2，4-D处理的胚诱导率较高。 Malik等[19]在进行甜瓜未授粉子房培养时发现，0.04 mg/L和0.02 mg/L的TDZ在诱导培养基中显著增加胚珠愈伤产生，胚诱导率分别为46.6%和65.83%，而浓度为0.6 mg/L的6-BA激素显著提高外植体再生率。

Diao等[16]认为，TDZ能促进胚胎形成，以

0.04 mg/L的TDZ效果最佳。而将AgNO3加到诱导培养基中对胚的诱导并没有显著影响，但会缩短胚胎萌芽期和提高胚胎形成数目，其选用的材料之间出胚率并无显著差异。谢冰等[7]将西葫芦未授粉胚珠接种至含不同浓度2，4-D，NAA，BA的N6培养基上，结果发现，2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L NAA+

1 mg/L BA培养基上的胚状体诱导频率最高。刘栓桃等[8]通过对4个西葫芦品种研究结果表明，在浓度为0.5 mg/L NAA和1.0 mg/L的2，4-D的培养基上再生植株产率最高，达28.33%。

2.5 琼脂和蔗糖浓度

陈学军等[6]发现，西葫芦胚珠愈伤组织诱导成苗阶段，蔗糖浓度为20 g/L的培养基上芽诱导率最高，为15.6%。Shalaby[10]在南瓜Eskandrani胚珠诱导时使用30，60，90 g/L的蔗糖浓度梯度比较发现，蔗糖浓度为30 g/L时，胚珠诱导效率最佳，而蔗糖浓度为90 g/L时，胚珠完全不能生长。这些结果表明，在愈伤组织芽分化时可能需要较低的渗透压。

此外，AgNO3是乙烯合成的抑制剂，Mohiuddin等[21]认为，AgNO3影响愈伤组织的内源激素代谢从而有利于葫芦科植物植株的再生。陈学军等[6]研究发现NO3-有利于不定根的形成。韩丽华等[22]将甜瓜胚珠用不同浓度的硝酸银进行处理，结果显示在硝酸银浓度为80 mg/L时出胚率最高，为0.74%。

3 未授粉子房培养展望

葫芦科植物具有很高的经济价值，通过单倍体离体诱导技术对葫芦科植物的品质、抗逆性、抗病害能力等进行改良，将会在葫芦科植物的遗传育种中开拓一条崭新的途径。自从20世纪60年代利用未授粉子房培养单倍体获得成功以来[23]，自然界植物的单倍体育种技术也取得长足的进步。通过未授粉子房培养单倍体的技术快速纯化葫芦科植物基因型，加快育种进度在葫芦科植物育种中具有重要意义。当前通过未授粉子房培养单倍体的方式在育种中已经取得了一些进步，但是当前葫芦科植物未授粉胚珠离体培养的过程中仍存在许多复杂的影响因素导致其诱导率、成胚率、成苗率较低等。因此通过改进实验技术来提高诱导效率，建立稳定性好，重复性高的未授粉子房离体培养技术在葫芦科植物育种中具有重要意义。

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Research Progress on Obtaining Cucurbitaceous Haploid through

Un-pollinated Ovary Culture

YANG Minggui， WANG Yuhong， LI Linzhang， WANG Chao， LU Yingying

（ Institute of Vegetables， Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Zhejiang 315040 ）

Abstract： In this paper， we summarized the recent research progresses on obtaining cucurbitaceous haploid through un-pollinated ovary culture， and analyzed the factors affecting the culture， such as the stage of explants， genotype， temperature pretreatments， auxin and so on. And we also discussed the existing problems and prospects of adopting the un-pollinated ovary culture method to obtain cucurbitaceous haploid.

Key words： Cucurbitaceae； Un-pollinated ovaries； Haploid