n分析'> 苦碟子药材及其注射液中化学成分的HPLC―ESI―MSn分析

[摘要] 应用 HPLC-ESI-MSn建立1种苦碟子药材及其注射液的快速定性分析方法。通过与对照品保留时间、多级质谱信息对照，快速定性分析苦碟子药材及其注射液中的化学成分。共鉴定出33个化合物，核苷类3个、有机酸类16个、黄酮类7个以及倍半萜内酯类7个，其中通过对照品比对准确鉴定了12个化合物，11个化合物为首次在苦碟子中发现。结合已知化合物的裂解规律和未知化合物的多级质谱信息，对5个同分异构体的化合物结构进行了预测。所建立的苦碟子 HPLC-ESI-MSn定性分析方法简单、快速、高效，可以为苦碟子的质量控制和评价提供有效依据。

[关键词] 苦碟子；HPLC-ESI-MSn；裂解规律；核苷；有机酸；黄酮；倍半萜内酯

[收稿日期] 2013-03-29

[基金项目] 国家重点基础研究发展计划（973）项目（2012CB518406）

[通信作者] *乔延江，教授，Tel：（010）84738660，E-mail：

[作者简介] 刘颖，助理研究员，Tel：（010）64286052，E-mail： 苦碟子又名满天星，学名抱茎苦荬菜 Ixeris sonchifolia （Bge.）Hance，为菊科苦荬菜属植物。苦碟子注射液为抱茎苦荬菜提取物加工制备而成，具有活血止痛，清热祛瘀的功效，临床主要用于冠心病、心绞痛、急性脑梗死等。苦碟子注射液虽为单味药制剂，但其成分也较为复杂。已有研究显示，苦碟子中主要有核苷、有机酸、黄酮、倍半萜内酯和木脂素等类化合物[1-4]。如何较全面地快速阐明苦碟子的化学物质基础？常规的提取分离技术成本大，周期长，对环境污染较大，因此本研究采用 HPLC-ESI-MSn对苦碟子药材及其注射液中化学成分进行了快速定性分析，以期为苦碟子及其注射液的质量控制与安全性评价提供依据。

1 材料

Agilent 1100 型液相色谱仪，配有二元梯度泵、在线真空脱气装置、自动进样器、色谱柱恒温箱、光电二极管阵列检测器及 Chem Station 工作站；电喷雾离子源（ESI）-MSD Trap XCT plus 离子阱质谱仪（美国 Agilent 科技有限公司）；KQ-250DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Millipore Synergy UV型超纯水机（美国 Millipore 公司）；R200D 型电子分析天平（德国 Sartorius 公司）。

尿苷（批号120809）、鸟苷（批号120731）购买于上海融禾医药科技有限公司；腺苷（批号110879-200202）、咖啡酸（批号110885-200102）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（批号11720-201106）、木犀草素（批号111520-200504），购于中国食品药品检定研究院；3-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸与4，5-二咖啡酰奎宁酸，购于成都普瑞法科技开发有限公司；菊苣酸与芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，购于成都德天生物科技有限公司；纯度均大于98%。吉林通化华夏药业有限责任公司生产的苦碟子注射液（批号120414）凭处方购于北京中医药大学东方医院。苦碟子药材为吉林通化华夏药业有限责任公司提供，经北京中医药大学卢建秋研究员鉴定为菊科苦荬菜属植物抱茎苦荬菜 I. sonchifolia 的干燥地上部分；甲醇、乙腈（色谱纯，德国 Merck 公司），乙酸（色谱纯，美国 Tedia 公司），所用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的准备 分别取腺苷、3-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、菊苣酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和木犀草素标准品适量，加甲醇制成适宜浓度的储备液，后适当稀释制成混合对照溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取苦碟子药材粉末适量，加甲醇超声提取30 min，静置，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。取吉林通化华夏（批号120414）生产苦碟子注射液2支，混合后经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱条件 Thermo BDS hypersil C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm），流速1.0 mL・min-1，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量5 μL，流动相为乙腈（A）-0.5%乙酸溶液（B），洗脱梯度为：0 min，2%A，15 min，8%A，30 min，18%A，45 min，21%A，55 min，28%A。

2.2.2 质谱条件 采用ESI源，负离子模式，雾化气压力0.24 MPa（N2，>99.99%），干燥气流速（N2，>99.99%）11.0 L・min-1，干燥气温度350 ℃，毛细管电压3.5 kV，全扫描范围为 m/z 100～800，3 级碎片扫描，多级质谱的碰撞电压为1 V。

2.3 苦碟子药材及其注射液 HPLC-ESI-MSn分析结果

应用 HPLC-DAD-ESI-MSn整体分析苦碟子药材及其注射液各类成分：根据多级质谱的碎片信息，采取对照品对照和参考已有文献的方式，对苦碟子药材及其注射液中4大类成分共33种化合物进行了快速鉴定，并依据已知化合物的裂解规律推断了5个互为同分异构体的未知化合物。混合对照品、苦碟子药材和苦碟子注射液的 HPLC-DAD 图与总离子流图（TIC）分别见图1，2，各类成分的归属信息见表1，结构式见图3。

2.4 4类成分裂解规律分析

2.4.1 核苷类化合物的鉴定 通过与对照品的保留时间和质谱数据对照，参考相关文献[5]，化合物1～3分别为尿苷（uridine）、鸟苷（guanosine）、腺苷（adenosine），准分子离子分别为 m/z 243 [M-H]-，282[M-H]-，326[M+CH3COO]-； m/z 200，110分别为尿苷碎片离子[M-H-NHCO]-与[M-H-rib-H]-； m/z 150与 m/z 134分别为鸟苷与腺苷丢失1分子核糖后的碎片[M-H-rib] -， m/z 133为鸟苷碎片离子[M-H-rib-OH]-，根据质谱信息推断其裂解途径，见图4。鸟苷为首次在苦碟子中发现。

图1 对照品（A）、苦碟子药材（B）和苦碟子注射液（C）HPLC图

Fig.1 HPLC chromatograms of standards （A）， Ixeris sonchifolia （B） and its injection（C）

图2 对照品（A）、苦碟子药材（B）和苦碟子注射液（C）TIC（-）图

Fig.2 Total ion chromatogram of standards （A）， Ixeris sonchifolia （ B） and its injection（C） in negative mode表1 HPLC-ESI-MS/MS法苦碟子药材及其注射液的各峰归属

Table 1 MS and MS /MS data obtained from sample of Ixeris sonchifolia and its injection

注：1）下一级碎片离子的母离子；2）CA.caffeic acid，CQA.caffeoylquinic acid，DiCQA.dicaffeoylquinic acid，FQA.feruloylquinic acid， p CoQA. p-coumaroylquinic acid；3）准分子离子为[M+CH3COO]-；4）首次在苦碟子中发现的化合物；5）采用对照品对照的化合物；6）只在苦碟子药材中检测到的化合物；7）只在苦碟子注射液中检测到的化合物；8）信号太低难以检测。

图3 苦碟子药材及其注射液中33种成分的结构式

Fig.3 Structures of compounds in Ixeris sonchifolia and its injection

图4 鸟苷的裂解途径

Fig.4 The proposed fragmentation pathways for guanosine

2.4.2 有机酸类化合物的鉴定 通过与对照品的保留时间和质谱数据相对照，化合物6，10，12，13，16，22，23，28分别鉴定为3-咖啡酰奎宁酸、5-咖啡酰奎宁酸、4-咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、菊苣酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸与4，5-二咖啡酰奎宁酸；化合物6，10，12与化合物22，23，28分别为2组同分异构体，由质谱碎片的不同以及相同种类碎片丰度的不同，推断咖啡酰基的取代位置。

m/z 353为单咖啡酰奎宁酸（CQA）负离子模式的准分子离子[M-H]-，分子式为C16H17O9。其ESI-MS2谱碎片具有明显的自身特征，多存在 m/z 191， 179， 173， 135特征离子碎片， m/z 191或 m/z 173表明存在奎宁酸基团， m/z 179或 m/z 135表明存在咖啡酸基团，4个离子分别推断为[quinic acid-H]-，[caffeic acid-H]-，[quinic acid-H2O-H]-和[caffeic acid-CO2-H]-。4-位取代时，ESI-MS2谱的基峰离子为 m/z 173，而1，3和5位取代的基峰离子为 m/z 191；3位取代时， m/z 179相对丰度较1和5位取代要高；根据在反相柱中洗脱顺序，推断化合物4为1-CQA[6]。以4-CQA为例阐释单咖啡酰奎宁酸可能的裂解途径，见图5，矩形框内为4种取代的单咖啡酰奎宁酸可能产生的丰度相对较高的碎片离子。

图5 单咖啡酰奎宁酸可能的裂解途径（以4-CQA为例）

Fig.5 The proposed fragmentation pathways of CQA （taking 4-CQA for example）

m/z 515为二咖啡酰奎宁酸（DiCQA）负离子模式的准分子离子[M-H]-，分子式为C25H23O12。多级质谱主要特征离子碎片为 m/z 353，335，191，179，173和135，可依据质谱碎片离子种类和丰度的差异鉴定 m/z 515的4种同分异构体：1，3-位取代时，其ESI-MS2谱中 m/z 335 [M-H2O-H]-碎片离子丰度较其他3种化合物高；4-位取代时ESI-MS3谱中基峰离子为 m/z 173，碎片 m/z 191的丰度3，4-位取代较4，5-位取代略高；基峰离子为 m/z 191 时可能是1-，3-和5-位取代，且5-位取代时， m/z 179相对丰度较1-和3-位取代要高，依此区别1，3-位取代与3，5-位取代。因反相色谱柱中，1，3-DiCQA较3，4-DiCQA先被洗脱，推断化合物15为1，3-DiCQA。以3，4-DiCQA为列阐释二咖啡酰奎宁酸可能的裂解途径，见图6。

图6 二咖啡酰奎宁酸类化合物可能的裂解途径（3，4-DiCQA为例）

Fig.6 The proposed fragmentation pathways of DiCQA （taking 3，4-DiCQA for example）

化合物16与对照品比对，鉴定为菊苣酸（C22H18O12），即2，3-位分别由咖啡酰基取代的酒石酸，ESI-MS2谱中 m/z 311 [M-H-caffeoyl]-离子与ESI-MS3谱中 m/z 149 [tartaric acid-H]-， m/z 179 [caffeic acid-H]-离子分别为菊苣酸依次丢失162（咖啡酸酰化脱水）中性结构后的主要碎片离子。化合物5准分子离子为 m/z 311 [M-H]-，其ESI-MS2谱主要碎片离子为 m/z 179，149和 m/z 135，前2个碎片说明结构中存在一个咖啡酰基和1个酒石酸基团，ESI-MS3谱中 m/z 149 [tartaric acid-H]-离子进一步裂解，生成质荷比为131的碎片离子，表明失去了1分子H2O，碎片 m/z 103可能为同时失去1分子H2O和CO的结构，推断该化合物为单咖啡酰酒石酸（3，4-dihydroxy-caftaric acid）；因ESI-MS2谱，ESI-MS3谱碎片离子分别为 m/z 179，135 [caffeic acid-CO2-H]-，表明结构中存在咖啡酰基，其准分子离子为 m/z 341 [M-H]-，可能为2分子咖啡酸缩合脱去1分子水的结构，推断化合物7可能为咖啡酸酐（caffeic anhydride）； m/z 163 [cinnamic acid-H]-，193[ferulicacid-H]-，191[quinic acid-H]-，173 [quinic acid-H-H2O]-分别为3-p CoQA，3-FQA，5-p CoQA，4-FQA的主要二级碎片离子，参考相关文献[6-7]，推断化合物9，11，14，17分别为3-肉桂酰奎宁酸，3-阿魏酰奎宁酸，5-肉桂酰奎宁酸，4-阿魏酰奎宁酸。

化合物4，5，7，9，11，12，14，17，22，23共10种有机酸首次在苦碟子中报道。

2.4.3 黄酮类化合物的鉴定 化合物21，27，31与对照品的保留时间和质谱数据比对，分别为木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素。 m/z 447，431分别为已知化合物21，27的准分子离子[M-H]-，其ESI-MS2谱征离子分别为 m/z 285，269，即失去1个162（端基六碳糖基）的中性碎片后生成[M-H-162]-的离子。化合物18，20，25的准分子离子分别为 m/z 609，461，445，其ESI-MS2谱征离子分别为丢失1个324（1分子双糖糖苷化脱去1分子水），176（葡萄糖醛酸取代基）的中性碎片后生成 m/z 285 [M-H-324]-，285 [M-H-176]-，269 [M-H-176]-。 m/z 591为化合物33的准分子离子[M-H]-，ESI-MS2谱中 m/z 283为失去146（端基脱氧六碳糖基）和162（端基六碳糖基）中性结构的特征离子[M-H-146-162]-，ESI-MS2谱中 m/z 283进一步脱去甲基生成 m/z 268碎片离子[M-H-146-162-15]-，与文献报道一致[8]，依此推断化合物33为蒙花苷。黄酮类化合物苷元在电喷雾质谱条件下的裂解主要发生在C环上（RDA裂解）[9]。 m/z 285为化合物31（木犀草素）的准分子离子[M-H]-，与文献[10]中离子碎片 m/z 243 [M-H-C2H2O]-，241 [M-H-CO2]-，217 [M-H-C3O2]-，199 [M-H-C2H2O-CO2]-，175[M-H-C3O2-C2H2O]-，151 （1，3A-），133 （1，3B-） 数据一致。

2.4.4 倍半萜内酯类化合物的鉴定 倍半萜内酯类化合物紫外无特征吸收，质谱数据显示苦碟子中倍半萜内酯种类较多。根据多级质谱信息并参照相关文献[11-12]分析，化合物8，19，24，26，29，30，32可能为11，13-dihydro-13-prolyl-ixerin Z，sonchifolactone D，11 β-hydroxyleucodin-11-O-β-glucopyranoside，ixerin Z，11 β-hydroxyleucodin-11-O-β-glucopyranoside isomer，11 β ，13-dihydroixerin Z，11，13- dihydro-13- prolyl -ixerin Z1，为愈创木烷型倍半萜内酯类化合物。

化合物24与29在负离子模式下生成[M + CH3COO]-或[M-H]-离子，二者互为同分异构体。化合物29的ESI-MS2谱中具有与化合物24的ESI-MS3谱中相同的基峰 m/z 243 [M-H-162-H2O]-（失去1分子葡萄糖基后脱水）和 m/z 199 [M-H-162-H2O-CO2]-。化合物26的ESI-MS2谱中， m/z 421 [M-H]-离子分别丢失了1分子葡萄糖（162）和脱葡萄糖基后脱水（180）生成 m/z 259，241的产物离子；ESI-MS3谱中显示 m/z 259经过碰撞诱导解离，丢失44结构生成 γ-内酯环特征碎片 m/z 215 [M-H-162-CO2]-离子，且 m/z 215进一步裂解为 m/z 197 [M-H-162-CO2-H2O]-，200 [M-H-162-CO2-CH3]-和 m/z 187 [M-H-162-CO2-CO]-的产物离子。化合物19与文献[12]报道的sonchifolactone D相对分子质量一致，ESI-MS2谱特征碎片离子 m/z 421为准分子离子脱去1分子水，与化合物26的碎片离子 m/z 259，241以及 m/z 215相同，应为含有1分子葡萄糖的倍半萜内酯苷类化合物。化合物30特征碎片离子为 m/z 217 [M-H-162-CO2]-，187 [M-H-162]-，与文献中11 β ，13-dihydroixerin Z数据一致。化合物32与文献[12]中11，13-dihydro-13-prolyl-ixerin Z1数据一致。

化合物34～38具有相同的质荷比和碎片种类，推断为具有相同母核的同分异构体。同分异构体的5种未知化合物准分子离子峰为 m/z 538[M-H]-，二级质谱的基峰为 m/z 423或 m/z 243，丢失碎片 m/z 115，参照化合物8，32结构信息，相当于丢失1分子脯氨酸，多级质谱碎片种类和数量与倍半萜内酯类化合物24（ m/z 423[M-H]-）近似，推测可能为倍半萜内酯类化合物，分子式为C26H37NO11。

化合物32与芦丁仅在苦碟子药材中发现，可能在注射液制备过程中发生了水解反应。化合物4，9仅在注射液中发现，药材中未检测到，推测可能为酚酸类化合物不稳定，在注射液制备过程中由于异构体的转化产生新物质。

3 小结

本实验对苦碟子药材及其注射液中核苷、有机酸、黄酮和倍半萜内酯4大类成分进行了质谱裂解规律的探讨，结合对照品，对主要特征峰进行了归属，并对其裂解途径进行了分析。应用HPLC-ESI-MSn分析了苦碟子药材中核苷类3个、黄酮类7个、倍半萜内酯类12个、有机酸类14个共36个化合物，其中互为同分异构体的5个未知化合物可能为倍半萜内酯类化合物；鉴定了苦碟子注射液中核苷类3个、黄酮类7个、倍半萜内酯类6个、有机酸类16个共32个化合物。其中鸟苷，1-CQA，3-CQA，4-CQA，3-p CoQA，3-FQA，5-p CoQA，4-FQA，3，4-DiCQA与3，5-DiCQA在苦碟子中为首次发现。

本研究基本阐明了苦碟子及其注射液中的化学成分，为其化学成分的进一步研究和质量评价提供了重要依据。

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Identification of chemical component from Ixeris sonchifolia and

its injection by HPLC-ESI-MSn

LIU Ying1，2， LU Jian-qiu1， ZHAGN Jia-yuWANG Fang2， WANG Qing2， QIAO Yan-jiang（1. Center of Scientific Experiment， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] A rapid analytical method was developed for the identification of components in Ixeris sonchifolia and its injection by HPLC-ESI-MSn. The characterization of various components was analyzed according to the retention time of reference standard and mass spectrometry information. A profile of I. sonchifolia and its injection constituents was described and a total of three nucleosides， sixteen phenolic acids， seven flavonoids and twelve sesquiterpene lactones were identified or tentatively characterised. Twelve compounds were accurately identified with reference standards. Eleven of them， guanosine， 1-caffeoylquinic acid， 3-caffeoylquinic acid， 4-caffeoylquinic acid， caffeic anhydride， 3，4-dicaffeoylquinic acid， 3，5-dicaffeoylquinic acid， 3-p-coumaroylquinic acid， 3-feruloylquinic acid， 5-p-coumaroylquinic acid and 4-feruloylquinic acid were reported for the first time in I. sonchifolia and its preparations. The structures of five isomers were deduced by theirs mass information and the fragmentation pattern of known compounds. The developed method was useful for the quality control and evaluation of this herb and its preparations. The HPLC-ESI-MSn could be a promising tool for the rapid analysis of components from herbal medicines.

[Key words] Ixeris sonchifolia ； HPLC-ESI-MSn； fragmentation pattern； nucleosides； phenolic acids； flavonoids； sesquiterpene lactones

doi：10.4268/cjcmm20131627