GSNO对人肺腺癌A549细胞的作用

[摘要] 目的 观察S-亚硝基谷胱甘肽（gsno）对人肺腺癌a549细胞的作用，为GSNO作为药物来治疗肺癌提供依据。 方法 培养的A549细胞分别给予0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L GSNO 5个剂量，并分别培养24、48、72 h，应用CCK8试剂检测IC50；应用CCK8试剂检测二硫苏糖醇（DTT）逆转GSNO作用的给药时间点；应用原位凋亡荧光检测试剂盒检测GSNO给药组和GSNO联合DTT给药组中A549细胞的凋亡情况。 结果 GSNO分别处理24、48、72 h后检测，结果IC50分别为18.174、2.020、1.836 mmol/L；在GSNO给予20、40 min后给予DTT，结果OD值显著提高（P

[关键词] S-亚硝基谷胱甘肽；二硫苏糖醇；A549；肺癌

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（b）-0008-04

肺癌是最常见的恶性肿瘤，在全世界显示有极强的患病率和致死率。A549细胞是来源于肺泡上皮细胞的恶性细胞系，它是体外研究人肺腺癌的标准细胞[1]。S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）是机体存在的一种内源性一氧化氮（nitric oxide，NO）供体。GSNO在体内可被迅速分解释放出NO，GSNO释放出NO后生成的副产物没有毒性。GSNO在体外是一种NO缓释剂，其特点是在细胞培养液中可持续、稳定地释放NO[2-3]。大量研究报道，NO具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[4-6]。二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）是一种小分子的有机还原剂，DTT的用途除了作为还原剂和去保护剂，也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键[7]。目前在已证实有治疗作用的内源性S-亚硝基硫酸类化合物中，GSNO因在溶液中相对稳定而最具应用前景。DTT在本研究中主要用作GSNO的拮抗剂。

1材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

人肺腺癌A549细胞（中科院上海细胞所）；RPMI 1640培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK8（Dojindo实验室，日本）；细胞原位凋亡荧光检测试剂盒（Roche公司，美国）；BioTek酶标仪（Sigma公司，美国）；Zeiss倒置显微镜（德国）；Olympus倒置荧光显微镜（日本）；96孔板（Corning公司，美国）。

1.2 细胞培养方法

将人肺腺癌A549细胞放于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，按常规方法进行传代培养。细胞呈单层贴壁生长。实验均取对数生长期的细胞。

1.3实验分组及处理

分别检测生理盐水对照组、GSNO给药组（根据GSNO IC50测定结果给予2 mmol/L）、GSNO联合DTT给药组（给予GSNO后，分别在20、40、60、80、100 min后给予10 mmol/L DTT处理）。

1.4 GSNO对细胞抑制率的计算

A549细胞以每孔含1×104个细胞，体积为100 μl的密度种植于96孔板。贴壁过夜，给予GSNO处理（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L），分别培养24、48、72 h后，每孔加入CCK8 100 μl，培养箱中孵育1 h后在酶标仪上检测吸光度值（波长为490 nm）。其中细胞抑制率（inhibitory ratios，IR）=（GSNO给药组平均吸光度值-GSNO联合DTT给药组平均吸光度值）/ GSNO给药组平均吸光度值×100%。

1.5 细胞凋亡检测

A549细胞（1×105个细胞/孔）种植于12孔板（Corning公司，美国），分别给予同体积生理盐水、2 mmol/L GSNO和2 mmol/L GSNO+10 mmol/L DTT（GSNO处理40 min之后加）。培养48 h后，用4%的冰多聚甲醛-PBS溶液固定15 min，PBS清洗3次，加2 μg/ml DAPI在37℃下避光染20 min，接下来的凋亡检测则根据细胞原位凋亡荧光检测试剂盒中的步骤进行。在倒置荧光显微镜下进行避光拍照。

1.6统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，若方差齐，采用SNK检验；若方差不齐，采用Games-Howell检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。采用直线回归法计算IC50值。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 GSNO对A549细胞抑制作用

A549细胞分别给予0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L GSNO，处理24、48、72 h后检测，IC50结果分别为18.174、2.020、1.836 mmol/L，抑制率见表1。A549细胞在给予2 mmol/L GSNO处理后分别在20、40、60、80、100 min后给予DTT处理，结果显示，与GSNO给药组比较，在GSNO给予20、40 min后给予DTT，其OD值显著提高（P

表1 不同浓度GSNO处理后A549细胞的抑制率（%，x±s）

时间（min）

图1 CCK8试剂检测不同时间段细胞增殖的吸光度值（n=6）

与GSNO给药组比较，*P

2.2 GSNO作用后A549细胞的凋亡情况

DAPI染所有的有核细胞，凋亡的细胞显示绿色荧光染色。与生理盐水对照组比较，GSNO给药组显示凋亡细胞大量增加；而与GSNO给药组比较，GSNO处理20 min后给予DTT的GSNO联合DTT给药组显示凋亡细胞减少（图2）。

A B

C

图2 A549 细胞凋亡染色（20×，标尺大小=50 μm）

A：生理盐水对照组；B：GSNO给药组；C：GSNO联合DTT给药组

3讨论

GSNO作为一种新的脂溶性NO前体药物，具有半衰期长、极易穿透细胞膜、进入细胞内释放NO、使细胞内的NO浓度迅速提高等特点[8]。正常情况下，GSNO在体内存在处于一个动态平衡。GSNO可引起过量NO释放从而引起系列自由电子基的级联反应，过量GSNO可引起内皮细胞线粒体依赖性凋亡，具有线粒体毒性作用，并可导致细胞凋亡或坏死[9-10]。有研究报道，GSNO可以促进巨核细胞株凋亡[11]，并诱导胸腺细胞凋亡[12]。然而，在临床上GSNO也有一定的治疗价值[13]。据报道，高浓度GSNO能诱导结肠癌细胞株凋亡，而低浓度则否[14]。本研究中，GSNO的给药浓度超过IC50时对A549细胞的抑制率无显著提高。另外，给予GSNO处理48 h和72 h对A549细胞抑制率差异很小。因此，在接下来的实验中笔者采用GSNO的给药浓度是2 mmol/L。

有研究显示，GSNO的抑制作用能被DTT所逆转[15-16]。在本研究中DTT用来逆转GSNO的作用。但是，在GSNO给药60 min后给予DTT则显示无显著逆转作用。这一结果提示，在GSNO给药60 min内，GSNO已经造成了A549细胞不可逆的损伤。GSNO是机体存在的一种内源性NO供体，也是一种巯基试剂，能使有游离巯基的蛋白发生翻译后巯基-亚硝基化修饰[17-18]。也有研究报道，巯基还原剂DTT可用来逆转巯基-亚硝基化的修饰作用[19-20]。在本研究中，GSNO给药组A549细胞凋亡明显增加，在联合给予DTT后凋亡的细胞明显减少。结果提示，GSNO诱导的A549细胞凋亡可能与巯基-亚硝基化修饰作用有关。

凋亡是细胞死亡的主要形式，是机体正常发育和稳态维持的主要调控手段。细胞凋亡受抑制是癌细胞的基本特征之一。本研究的结论也提示细胞凋亡可能是GSNO抑制细胞生长的一个重要机制。目前的抗肿瘤治疗主要是通过促使细胞凋亡来实现，因此这个过程对于肿瘤的治疗具有明显的指导意义。

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（收稿日期：2015-01-22 本文编辑：卫 轲）