壮骨镇痛胶囊对乳腺癌细胞迁移运动信号通路关键蛋白p-JNK和Rac-1表达的影响

(1. 湖南中医药大学附属第一医院,湖南 长沙 410007;

2. 湖南中医药大学中西医结合学院,湖南省中医五官科重点学科,湖南 长沙 410007)

摘 要:目的:研究壮骨镇痛胶囊对高转移人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移及其运动信号通路关键蛋白p-JNK和Rac-1表达水平的影响。方法:采用划痕法测定高(5.0%)、中(1.25%)、低(0.63%)不同浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆对MDA-MB-231细胞迁移的影响,采用免疫细胞化学法检测不同浓度壮骨镇痛胶囊对MDA-MB-231细胞p-JNK和Rac-1蛋白表达水平的影响。结果:高、中浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆显著抑制了乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和p-JNK、Rac-1蛋白表达,低浓度血浆对细胞迁移和p-JNK、Rac-1蛋白表达无显著影响。结论:壮骨镇痛胶囊可通过改变运动信号通路关键蛋白p-JNK和Rac-1的表达来抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移,且该作用与浓度密切相关。

关键词:壮骨镇痛胶囊;乳腺癌细胞;迁移;p-JNK;Rac-1

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0802-03

The Effects of Zhuanggu Zhentong Capsules on the Expressions of Key Proteins in Migrating-Related Signaling Pathway Such as p-JNK and Rac-1of Breast Cancer Cell Lines in Vitro

LIU Jinghong1, HE Yingchun2, CAO Jianxiong1,WANG Xianwen1,TIAN Daofa2, ZHUO Yao1

(1.The First Affiliated Hospital, Changsha 410007, Hunan, China;

2.College of integrative medicine, Traditional Chinese Medical University of Hunan, Changsha 410007, Hunan,China)

Abstract:Objective:To study the impacts of Zhuanggu Zhentong Capsules(ZZC) on the cell migration and the expressions of key proteins in migrating-related signaling pathway such as p-JNK and Rac-1 of breast cancer cell lines MDA - MB -231 in vitro. Methods:The impacts of different doses of ZZC contained plasma (5.0%,1.25% and 0.63%) on the migrations of MDA - MB -231 cells in intro were measured by wound-healing assay. These proteins levels were assayed by immunocytochemistry protocol. Results: The cell migration and the expressive levels of p-JNK and Rac-1proteins in MDA - MB -231 cells treated with 5% ZZC contained plasma and 1.25% ZZC contained plasma were inhibited significantly. However, there are no obvious inhibitions on the cell migrations and p-JNK and Rac-1 proteins expressions in MDA - MB -231 cells treated with 0.63% ZZC contained plasma. Conclusion: ZZC contained plasma can inhibit the migrations of MDA - MB -231 cells in dose - dependent manner by changing the expressions of key proteins in migrating-related signaling pathway such as p-JNK and Rac-1 proteins.

Key words:Zhuanggu Zhentong capsules;breast cancer cell;p-JNK;Rac-1

[FQ(8。25,X-W]

收稿日期:2009-11-23

基金项目:湖南省科技厅资助项目(2007TP4021,湘财教指2009-42);湖南省教育厅资助项目(08C637,09C724)

作者简介:柳景红(1952-),男,湖南临湘人,教授,硕士研究生导师,学士,研究方向:恶性肿瘤的中西医结合防治。

通讯作者:曹建雄(1963-),男,湖南湘乡人,教授,硕士研究生导师,博士,研究方向:恶性肿瘤的中西医结合防治。

乳腺癌是最常见严重危害女性健康的恶性肿瘤之一,其发病率目前正逐年增高。自20世纪70年代,原为乳腺癌低发区的亚洲国家发病率逐年攀升,在我国特别是经济发达地区,乳腺癌已有成为威胁女性健康首要恶性肿瘤的趋势。乳腺癌的扩散转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。西医主要采取手术、放、化疗、内照射治疗、骨吸收抑制剂、内分泌等治疗,近期有一定疗效,但是副反应大,远期疗效不佳。中医药作为治疗骨转移瘤手段之一有较好疗效,甚或满意疗效,并且副反应少。壮骨镇痛胶囊方在我校附属医院肿瘤科已应用十余年,5年前已由医院制成了院内自制药使用至今,疗效确切,特别是对晚期乳腺癌的骨转移效果显著,取得了良好的社会效益和经济效益[1-4]。前期试验结果显示,高、中浓度壮骨镇痛胶囊可显著抑制高转移人乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外迁移,细胞迁移是一种复杂的细胞行为,需要通过多个信号分子发挥作用。本研究拟在通过检测壮骨镇痛胶囊干预前后的MDA-MB-231细胞迁移运动信号通路关键蛋白p-JNK和Rac-1表达水平,初步探讨其影响MDA-MB-231细胞迁移运动的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和细胞株SPF级SD大鼠由河南郑州大学实验动物中心提供(SCXK(豫)2005-0001)。乳腺癌可传代细胞株MDA-MB-231购自湘雅医学院细胞中心。

1.1.2 主要试剂及药物RPMI-1640培养基、0.25%胰酶-EDTA、D-Hanks液、鼠抗人p-JNK抗体、鼠抗人rac-1抗体购自Santa cruz公司, SABC染色试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉生物有限公司,其他试剂为国产分析纯。壮骨镇痛胶囊由湖南中医药大学附属第一医院制备,药物组成:骨碎补、仙灵脾、补骨脂、桑寄生、三七粉、莪术、延胡索、威灵仙、穿山甲、制地龙、全蝎、蜈蚣、生黄芪等组成。

1.1.3 仪器设备双人单面净化工作台(苏净集团),AE31型倒置显微镜(Motic公司),96孔,24孔,6孔培养板(Corning公司),微孔滤器(Pall公司),超纯水制备器 (Molecular),超声波清洗器(上海新苗医疗器械公司),MK3型酶标分析仪(Thermo Labsystems 雷勃公司),EBA12R 低温离心机(美国Beckman),CO2培养箱(美国Nuaire)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

参考文献[5]进行。复苏后接种于含15%胎牛血清RPMI-1640培养液中,在37℃、5%CO2条件下培养。

1.2.2 壮骨镇痛胶囊药物血浆的制备选用正常SD大鼠30只,随机分为药物组和生理盐水对照组,每组15只,自由饮水,摄食,保持自然光照饲养1周后,药物组灌胃壮骨镇痛胶囊,按人与动物用药剂量换算公式[大鼠剂量(g/kg)=6.25×成人剂量(g)/成人体重(60kg)]计算出一般给药量,该实验中的给药量为一般用量的3倍,对照组用等体积生理盐水灌胃。每天灌胃1次,连续7天;最后1天灌胃2次,间隔1h,末次给药后1h颈动脉采血,离心,取上清(即药物血浆),同组动物血浆混匀,经0.45μm过滤器过滤除菌,-20℃保存备用。

1.2.3 细胞迁移实验参照文献[6]进行。收获对数生长期的MDA-MB-231细胞,将细胞密度调整为5×105个/mL,接种于6孔板中,每孔3mL,待其贴壁后融合度约为85%~90%时,改为无血清RPIM-1640培养液继续培养24h后,吸弃培养液,用200μ L的tip头在孔内侧底面的中部从上向下均匀用力划一条宽度相等的细胞刮除带,并在底外面以蓝色记号笔划3条与刮出带垂直的线,换以高(5.00%)、中(1.25%)、低(0.63%)不同浓度含药血浆培养液,并且各药物组的培养液中分别加入正常大鼠血浆,使其最终血浆浓度均为5.00%,同时以5.00%正常大鼠血浆培养液作为对照组,每组设5个复孔,以划带时间为0 h,在倒置显微镜下分别观察0 h、24 h划带的宽度,每孔取3处划带宽度值求平均值,再求出每组24h 的细胞实际迁移距离平均值,比较各组细胞的迁移抑制率。

迁徙抑制率=(1一实验组迁徙距离/对照组迁徙距离)×100%

1.2.4 免疫细胞化学法将细胞按2×104/mL接种于24孔培养板内(1mL/孔),孔内预置无菌圆盖玻片。待细胞贴壁后,改为无血清RPMI-1640培养基继续培养24h,吸弃培养液,分别加入不同浓度药物血浆培养液,处理24h后,吸弃培养液,D-Hank’s液洗3次,80%的冰丙酮固定15～20min,弃丙酮,待玻片自然干燥后,参照文献[7]采用SABC法检测各蛋白水平。采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统摄像和进行图像分析,每个细胞玻片共检测5个阳性视野和5个阴性视野,取平均值,每组6次重复。以阳性视野和阴性视野灰度值的比值表示蛋白表达水平的高低,比值越高,蛋白表达水平越低。

1.2.5 统计学方法应用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学处理。计量资料结果用均数±标准差(±s)表示,多组比较采用单因素方差分析,并进行组间的多重比较,方差齐,采用LSD法;方差不齐,则采用Tamhane’s T2法比较。显著性检验取双侧界值点,P

2 结果与分析

2.1 不同浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆对MDA-MB-231细胞迁移的影响

与对照组比较,高、中浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆组乳腺癌细胞实际迁移距离明显减短(P

不同浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆对MDA-MB-231细胞迁移

2.2 不同浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆对MDA-MB-231细胞 p-JNK和Rac-1蛋白活性的影响

与对照组比较,高、中浓度壮骨镇痛胶囊含药血浆组p-JNK和Rac-1蛋白水平显著降低(P

3 讨 论

细胞迁徙在癌症、动脉粥样硬化等疾病中多见,阻止细胞迁移能延缓甚至抑制疾病的发展。国内外学者对各种肿瘤细胞的形态学进行了观察[8-10],认为肿瘤细胞的运动性与转移有密切关系。细胞迁移过程的每一步都需要有一系列的生化级联反应如细胞极性、微丝和微管的解聚和聚合

表1壮骨镇痛胶囊对MDA-MB-231细胞p-JNK和Rac-1蛋白的影响(n=6,±s)

组别含药血浆浓度(%)p-JNK灰度值比值Rac-1灰度值比值

对照组00.622±0.0370.666±0.044

高浓度组5.000.701±0.022**0.753±0.036**

中浓度组1.250.727±0.019**0.719±0.059*

低浓度组0.630.652±0.0220.655±0.028

统计量F值-20.2476.768

P -0.0000.002

注:与对照组比较*P

动态过程的调控、迁移过程中信号转导在时间和空间上的变化等[11]细胞迁移机制。肿瘤细胞的丝状伪足能够使癌细胞牢固地固定于器官表面,并沿器官表面移动及沿细胞之间的间隙向器官内移动[12]。侵袭部分癌细胞丝状伪足与器官表面突起部分连接或与靶细胞直接黏附,还有部分癌细胞丝状伪足吞噬靶细胞使癌细胞的迁移能力增加导致肿瘤转移。本实验结果显示,高、中浓度壮骨镇痛胶囊对乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外迁移具有显著的抑制效应,并且抑制了细胞伪足生长,证实了乳腺癌细胞的生长形态及形态学改变与它自身的生长状态、转移都有密切关系,而低浓度壮骨镇痛胶囊对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移无显著影响,表明该效应与浓度密切相关。

Rac-1,Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1),是Rho(Ras homologous)家族的GTPases中研究的较多的因子,其功能包括:对细胞骨架的作用,如在成纤维细胞肌动蛋白骨架形成中,导致细胞伪足和膜褶皱样运动;对细胞黏附的作用,并且通过影响RhoA的活性,间接影响细胞胞体的收缩;在肿瘤发生发展中的作用[13],诱导integrin重新募集于细胞头部,从而提供细胞迁移的正反馈调节。也可参与调控上皮肿瘤发生密切相关的钙黏蛋白依赖性的细胞间黏附,并且与细胞移行的关系密切[14],如Rac-1能在内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞迁移中也发挥重要作用[15]。本实验中,高、中浓度壮骨镇痛胶囊显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外迁移,相应的,这两组细胞中rac-1表达水平降低,笔者的研究结果与前面报道一致。

JNK(stressactivated protein kinases,SAPK,应激活化的蛋白激酶),丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)级联系统是细胞内重要的信号转导系统。多种胞外刺激因子可激活以JNK为中心的JNK信号转导通路,一些抑癌基因编码产物抑制 JNK的功能或活化。JNK活化以后,可以通过磷酸化作用调控多种底物的功能活性。几种控制细胞迁移的信号通路包括Rac, FAK和Src与JNK信号通路密切相关,并且JNK信号通路是细胞迁移过程中所必需的[16-17],用其抑制剂SP600125抑制JNK活化可抑制细胞的迁移[18]。

综上所述,壮骨镇痛胶囊抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的作用机制之一是通过影响p-JNK和Rac-1蛋白表达,改变JNK―RAC1信号传导通路中的信号,导致伪足和丝状伪足生成减少,进而使乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力降低。

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