刺蓝抗疲劳口服液质量标准研究

基金项目：湖南省科技厅基础研究项目（2010FJ3105）

作者单位：410007 湖南中医药大学附属第一医院（李康）；湖南省中医药研究院（李柯，陈丹，李若存）

通讯作者：李康

【摘要】 目的 建立刺蓝抗疲劳口服液的质量标准。方法 采用薄层色谱法对处方中的刺五加、绞股蓝、枸杞子、甘草进行鉴别；用高效液相色谱法对成品中紫丁香苷进行含量测定。结果 薄层色谱中能检出刺五加、绞股蓝、枸杞子、甘草；紫丁香苷在0.168～1.848 μg范围呈良好的线性关系，r0.9997，平均回收率98.6%，RSD为2.43%。结论 所建立的方法能够用于本品的质量控制。

【关键词】 刺蓝抗疲劳口服液； 薄层色谱法； 紫丁香苷； 高效液相色谱法

Study on quality standard for Cilan Kangpilao oral liquid LI Kang,LI Ke,CHEN Dan,LI Ruo-cun.The First Affiliated Hospital in Hunan University of Traditional Medicine，Changsha 410007,China

【Abstract】 Objective To establish quality standards for Cilan Kanpilao oral liquid.Methods TLC on prescription of Acanthopanax, wolfberry fruit, Gynostemma, licorice for identification; HPLC method with the finished Syringin, determine the content of ginsenoside Rb1.Results Acanthopanax was detected by TLC, Gynostemma, wolfberry fruit, liquorice; Syringin in the range of 0.168～1.848 μg was a good linear relationship,r0.9997, average recovery was 98.6%, RSD 2.43%.Conclusion The method can be used for the quality control of Cilan Kangpilao oral liquid.

【Key words】 Cilan Kangpilao oral liquid; Thin layer chromatography; Syringin; High performance liquid chromatography

刺蓝抗疲劳口服液由刺五加、绞股蓝、枸杞子、甘草组方研制而成的中药6类新药，功能调补气血、强精神、益气力，用于术后疲劳综合征，证属气血亏虚者。为了有效地控制其质量，笔者采用薄层色谱法对制剂中的刺五加、绞股蓝、枸杞子、甘草进行了鉴别，采用高效液相色谱法对刺五加的紫丁香苷进行了含量测定，现报道如下。

1 仪器与试剂

LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津）；C18（Column 200 mm×4.6 mm，5 μ）色谱柱（大连依利特分析仪器有限公司）；N2000数据处理软件（浙江大学智能信息工程研究所）。刺五加对照药材（批号:120991-200807）、人参二醇（批号：701-9405）、甜菜碱（批号:110894-200503）、甘草对照药材（批号:120904-200511）、紫丁香苷对照品 （批号：111574-200502）均为中国药品生物制品检定所提供。甲醇（色谱纯试剂，天津科密欧化学试剂有限公司），水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯（均为湖南汇虹试剂有限公司提供）。刺蓝抗疲劳口服液（批号：20090908、20090914、20090916、20090918）由湖南省中医药研究院中药研究所制剂室提供。

2 薄层色谱鉴别

2.1 刺五加鉴别 取三批样品各10 ml，分别用正丁醇15 ml振摇提取，取正丁醇液层，蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。另取刺五加对照药材3 g，加甲醇20 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为对照药材溶液。取除刺五加外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺刺五加的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺刺五加的阴性溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（6∶2∶1）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干, 喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰［1～2］。

2.2 绞股蓝的鉴别 取三批样品各10 ml，分别用正丁醇15 ml振摇提取，取正丁醇液蒸干，残渣加硫酸的45%乙醇溶液（7100）15 ml，加热回流1 h，挥去乙醇，用三氯甲烷10 ml振摇提取，分取三氯甲烷液，用水洗2次，每次10 ml，三氯甲烷液用适量无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 ml溶解，作为供试品溶液。另取人参二醇对照品，加无水乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取除绞股蓝外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺绞股蓝的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺绞股蓝的阴性溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮（2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。

2.3 枸杞子的鉴别 取三批样品各10 ml，分别置于已处理好的732阳型离子交换树脂柱（1.0 cm×12 cm）上，用水洗至无色，再用5%氨水25 ml洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加乙醇15 ml加热提取，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 ml溶解，作为供试品溶液。另取甜菜碱对照品，加乙醇制成每1 ml含3 mg的溶液，作为对照品溶液。取除枸杞子外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺枸杞子的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺枸杞子的阴性溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-无水乙醇-盐酸（10∶6∶1）为展开剂，预饱和30 min，展开，取出，晾干, 喷以新配制的改良碘化铋钾试液，用电吹风加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。

2.4 甘草的鉴别 取三批样品各5 ml，分别用乙酸乙酯10 ml振摇提取，提取液浓缩至1 ml，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.5 g，加乙醇20 ml，加热回流0.5 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 ml溶解，溶液按供试品方法制成2 ml对照药材溶液。取除甘草外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺甘草的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺甘草的阴性溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（13∶87）为流动相；检测波长为265 nm。理论板数按紫丁香苷峰计不低于2000。

3.2 对照品溶液的制备 取在110 ℃干燥至恒重的紫丁香苷对照品约8 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

3.3 供试品溶液的制备 精密量取本品2 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性溶液的制备 取除刺五加外的其余处方量药材，按制备工艺方法制备缺刺五加的阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成缺刺五加的阴性溶液。

3.5 干扰试验 分别精密吸取对照品溶液、阴性溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，结果表明，阴性对照液在紫丁香苷保留时间处无吸收。

3.6 线性关系考察 精密吸取紫丁香苷（C0.168 mg/ml）对照品溶液1、3、5、7、9、11 μl进样，测定其峰面积积分值。以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y1E+06x+16149，r0.9997。结果表明紫丁香苷在0.168～1.848 μg范围内具有良好的线性关系。

3.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μl，重复进样5次，测定其峰面积积分值计算RSD（%）为2.76%，说明精密度良好。

3.8 稳定性试验 分别精密吸取供试品溶液10 μl，于0、4、8、12、24 h进样，测定其峰面积积分值。计算结果RSD（%）为3.24%，说明24 h内供试液稳定性良好。

3.9 重复性试验 取同一批号样品（批号：20090908）按上述条件，测定5次，测定其峰面积积分值。结果RSD（%）为3.60%，说明方法重复性好。

3.10 回收率试验 精密量取已知含量为0.24 mg/ml（批号：20090908）样品2 ml，共6份，分别精密加入紫丁香苷对照品溶液（0.168 mg/ml）3.0 ml，即0.504 mg，按含量测定项下的方法测定含量，计算回收率，平均值为98.60%， RSD为2.43%。结果见表1。

表1 回收率测定结果表

3.11 样品含量测定取三批样品， 按上述方法测定，结果见表2。

4 讨论

4.1 薄层色谱鉴别 刺五加主要含苷类、黄酮类化合物，水溶性好，所以采用正丁醇萃取，浓缩后用甲醇溶解制成供试品溶液，与对照药材对照，喷以10%硫酸乙醇溶液加热显色，

表2 样品含量测定 （n3）

呈现一个蓝色斑点，此斑点为紫丁香的特征斑点，经三批样品实验观察，阴性未见干扰，确认上述方法可行。

据文献报道，从绞股蓝中分离到80多种皂苷，其中皂苷Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅻ结构和人参皂苷（gensenoside）-Rb1、Rb3、Rd、F2相同［3］。在TLC法，拟采用Rb1化学对照品鉴别方中的绞股蓝，但阴性有干扰，未获成功；后经反复试验，确定了皂苷类成分水解，以人参二醇对照品鉴别方中绞股蓝的方法，经三批产品检验，表明本法成立。

枸杞子的薄层鉴别方法无论是枸杞子药材，还是含枸杞子的制剂，往往采用在紫外灯下（365 nm）检视东茛菪内酯的方法，试验过程中发现本品中刺五加所含的异秦皮啶与枸杞子所含的东茛菪内酯因结构类同，用多种展开系统未能达到理想的效果，且条件难控制，所以根据枸杞子所含甜菜碱的性质，用本品上阳树脂再用稀氨水洗脱，浓缩后用乙醇制成供试品溶液，经缺枸杞子阴性对照，供试品色谱无干扰。

甘草主要含三萜皂苷、黄酮类化合物，采用乙酸乙酯直接萃取本品，得到甘草黄酮类化合物，供试品干净。经薄层试验结果表明，其TLC分离效果好，斑点清晰。取缺甘草的阴性溶液，经同法薄层分离，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上无相同颜色的斑点，说明缺甘草的阴性溶液无干扰。

4.2 含量测定 刺五加为方中君药，功能为益气健脾、补肾安神，所含的紫丁香苷为方中抗疲劳的主要有效成分之一。根据本制剂的特点，选用HPLC测定紫丁香苷含量作为本制剂的含量测定指标，既可以较好控制制剂成品的质量，也可以作为提取工艺的控制指标。供试品溶液制备采用直接取样甲醇稀释的方法制备，目标成分损失较少，稳定性良好，且操作简便，易于掌握［4～6］。据文献报道，紫丁香苷的HPLC含量测定多采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-冰醋酸等溶液配比作为流动相［7］。本试验结果显示，以甲醇-水（13∶87）为流动相，紫丁香苷色谱峰能够达到基线分离，重复性良好（RSD3.60%）,刺五加阴性供试品无干扰,回收率达到97.6%。

参 考 文 献

［1］ 吕武清.中成药中的药材薄层色谱鉴别.北京:人民卫生出版社,1997：35.

［2］ 王宝琴.中成药质量标准与标准物质的研究.北京:中国医药科技出版社,1994：1-5.

［3］ 陈发奎.常用中草药有效成分含量测定.北京:人民卫生出版社,1997：12-17.

［4］ 王喜军.高效液相色谱在中药研究中的应用.黑龙江:黑龙江科学出版社,1994：15-17.

［5］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部.北京:化学工业出版社，2005：143，174.

［6］ 李若存,易大年,朱绍雄,等.绞股蓝中三萜皂苷元的分离和结构鉴定.南京大学学报（绞股蓝专辑）,1993,71-74.

［7］ 阮洪生,王伟明,张洪娟.HPLC测定刺五加及其制剂中药效成分的研究进展.黑龙江中医药,2006,3:57-59.

（收稿日期：2011-04-01）