基于COI序列的哈蟆油基原动物DNA条形码鉴定研究

【前言】基于COI序列的哈蟆油基原动物DNA条形码鉴定研究由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。[Abstract] Ranae Oviductus has a high economic and social value， but its adulterants are more numerous， which causes a great confusion to the market. Using DNA bar code technology based on COI sequence for PCR amplification and sequencing of the ...

[摘要] 哈蟆油具有较高的经济和社会价值，其混伪品较多，给市场造成了很大的混乱。利用基于coi序列的DNA条形码技术对已鉴定的东北林蛙、中国林蛙、桓仁林蛙和黑龙江林蛙进行PCR扩增和测序，建立4种林蛙COI基因数据库；将所测的序列与GenBank上的序列进行比对，显示为上述4种林蛙；应用MEGA（molecular evolutionary genetics analysis）7.0软件计算K2P遗传距离并构建NJ（neighbor-joining）系统聚类树，所测4种林蛙的序列和GenBank上下载的4种林蛙的序列分别聚为1支，但与GenBank上下载的2个外群独立分开，东北林蛙的COI基因可能存在地域性差异，但该技术并不能鉴别林蛙的雌雄。结果显示DNA条形码技术能够准确鉴定哈蟆油的基原动物，说明dna条形码COI为哈蟆油基原动物的鉴定提供一个新的手段和方法。

[关键词] 哈蟆油；东北林蛙；中国林蛙；DNA条形码；鉴定

Identification of Ranae Oviductus original animal based on COI sequences

WANG Meng-hu，KANG Ting-guo*，XU Liang*，YANG Yan-yun，CAI Zhen-jiao

（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

[Abstract] Ranae Oviductus has a high economic and social value， but its adulterants are more numerous， which causes a great confusion to the market. Using DNA bar code technology based on COI sequence for PCR amplification and sequencing of the identified Rana dybowskii， R. chensinensis， R. huanrensis and R. amurensiss， the COI gene database of four species of Rana was established， and comparing the measured sequence with the sequence of GenBank， four kinds of Rana were identified. The MEGA （molecular evolutionary genetics analysis） 7 .0 software was used to calculate the genetic distance of K2P and construct the NJ （neighbor-joining） system cluster tree. The sequence of the four species of Rana measured were clustered into one group with the sequence of the four kinds of Rana downloaded from GenBank， but separated from the two outer groups downloaded from GenBank. The COI gene of the R. dybowskii was likely to have regional differences， however this technique failed to distinguish male and female Rana. The results showed that DNA bar code technology could accurately identify the base of original animal of R. oviductus. It indicates that DNA bar code COI provides a new method for the identification of R. oviductus.

[Keywords] Ranae Oviductus； Rana dybowskii； Rana chensinensis； DNA barcode； identify

哈蟆油作槊贵动物药及滋补品，其性平，味甘、咸，归肺、肾经，具有补肾益精，养阴润肺的功效[1]。哈蟆油作为辽药六宝之一和辽宁特色的满药品种，其基原动物主要分布在长白山地区。过去在中国分布的林蛙命名比较混乱，各地区的林蛙命名经过几次变动。自1985年版《中国药典》至今记载哈蟆油的基原动物为中国林蛙Rana temporaria chensinensis[1]，近年来部分学者认为哈蟆油的基原动物为东北林蛙R. dybowkii[2-7]，我课题组对哈蟆油的基原动物进行考证，认为哈蟆油的基原动物为东北林蛙。《四库全书・盛京通志》记载“山蛤……多伏岩中，似rW而大，腹黄红色，俗称哈什蟆……”；《辽海丛书・沈故篇》记载“哈什马形似田鸡，腹有油如粉条，有子如鲜蟹黄，取以作羹，味极肥美，然唯与京一带有之。满洲人用以祭祖，取其也

。”[8]根据上述记载，“盛京”、“兴京”分别指今天的辽宁省沈阳市、辽宁省新宾满族自治县，说明哈蟆油的基原动物分布在辽宁地区，现在辽宁新宾依然是哈蟆油的主产区之一。本实验收集长白山地区的东北林蛙、桓仁林蛙和黑龙江林蛙与内蒙古地区的中国林蛙，并鉴定为上述4种林蛙。提取4种林蛙的总DNA，进行PCR扩增并测序，将所测序列与GenBank上的序列进行比对。本实验首次利用DNA条形码技术鉴定4种林蛙和对不同地域的东北林蛙进行鉴别，结果显示DNA条形码技术能够准确鉴定哈蟆油的基原动物；东北林蛙线粒体COI基因的2个位点呈现地域性的变异，该变异位点是否具有稳定性需要进一步研究。

1 材料

EPS-600型电泳仪，MG96G型聚合酶链反应（PCR）仪（杭州朗基科学仪器有限公司），Tanon-4100型凝胶图像处理系统（美国Applied Biosystems 公司），Fresco17/21型台式冷冻离心机（上海巴玖实业有限公司）。

Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，引物（北京天根生化科技有限公司），Trans 2K DNA Marker（宝生物工程（大连）有限公司），2×Taq MasterMix（北京康为试剂生物科技有限公司），琼脂糖和溴化乙锭（EB）均购自上海Sangon公司，其余均为分析纯。

实验样品及下载于GenBank的序列见表1，中国林蛙、桓仁林蛙、东北林蛙、黑龙江林蛙均经大连历史博物馆两栖动物研究员孙峰鉴定。

2 方法

2.1 DNA提取

用灭菌后的手术剪把样品（肌肉）剪碎，加液氮研磨，取约20 mg样品，使用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒（生工）提取总DNA，具体操作步骤按照试剂盒操作说明进行。

2.2 PCR扩增和电泳条件

引物为动物COI基因通用引物[9-11]，包括正、反2个方向，正向引物：LCO1490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向引物：HCO2198 5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAA-TCA-3′。PCR反应体积为50 μL，体系内含Taq Master Mix 25 μL，引物对各2.0 μL（10 μmol・L-1），DNA提取液4 μL，加去RNA酶水补足至50 μL。扩增程序为：95 ℃，3 min；94 ℃，40 s，35～42 ℃，1 min，72 ℃，1 min，35 个循环；72 ℃，10 min。取5 μL的PCR产物，用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，条件为100 V，230 mA，35 min。Marker采用宝生物（大连）DL 2000 Marker，Marker相对分子质量标准从上至下为2 000，1 000，750，500，250，100 bp。

2.3 序列测序及数据处理

PCR扩增产物使用 ABI 3730 XL 测序仪（华大基因公司）双向测序，测序后得到正反两向峰图，利用Codoncode Aligner V 6.0.2[12]进行峰D的查看、拼接及比对。当目的序列低于800 bp时，需去除拼接后的引物序列，但引物序列均在前30 bp和后30 bp的不稳定区且拼接后的长度也不相同，故在去除引物区这一步骤需手动去除不稳定的引物区。实验所测序列拼接后的序列长度在690～710 bp，陈士林[13]用COI基因通用引物测得中国林蛙序列为658 bp，均低于800 bp，需手动去除拼接后的引物区。对于从Genbank获得的COI序列，采用Codoncode Aligner v 6.0.2软件，与拼接好的样品序列比对后，去除与样品序列相对应的658 bp以外的区段。所有序列应用MEGA 7.0[14]软件比对并计算K2P遗传距离[15]、建立NJ系统聚类树[16]，在GenBank上进行BLAST相似性搜索法[17-18]进行序列的比对分析，验证各物种。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增

中国林蛙、桓仁林蛙、东北林蛙、黑龙江林蛙进行PCR时，中国林蛙退火温度为42 ℃，电泳样本10个，成功10个（1～10）；桓仁林蛙退火温度为42 ℃，电泳样本10个，成功各10个（11～20）；东北林蛙的退火温度为37 ℃，电泳样本75个，成功37个（21～57）；黑龙江林蛙的退火温度为35 ℃，电泳样本30个，成功2个（58～59）；以上所有成功的条带均在500～750 bp出现亮带。这表明，中国林蛙和桓仁林蛙DNA条形码获得条件通用，便于实践中应用，而东北林蛙和黑龙江林蛙不仅反应条件独特，而且成功率极低，分别为49%，6.7%，对于实践应用基本没有参考价值，见图1。

3.2 种内和种间变异分析

3.2.1 中国林蛙 中国林蛙10条序列比对后序列长度为658 bp，平均GC量为322，占48.9%。种内最大K2P距离为0.002，种内平均K2P距离为0.001。中国林蛙与桓仁林蛙、东北林蛙、黑龙江林蛙的种间遗传距离分别为0.022，

0.085，0.107；种间分别有24，85，101个不同的碱基；种内有1个变异位点，在第448位点有C/T变异，见图2。

3.2.2 东北林蛙 东北林蛙37条序列比对后序列长度为658 bp，平均GC量为325，占49.3%。种内最大K2P距离为0.011，种内平均K2P距离为0.003。东北林蛙与桓仁林蛙、黑龙江林蛙的种间遗传距离分别为0.081，0.115；种间分别有81，108个不同的碱基，种内有A/G，G/A，C/T，A/C等8个变异位点，见图2。

3.2.3 桓仁林蛙 桓仁林蛙10条序列比对后序列长度为658 bp，平均GC量为325，占49.4%，种内 K2P 距离为0.000。桓仁林蛙与黑龙江林蛙的种间遗传距离为0.102，种间有95个不同的碱基，种内有无变异位点，见图2。

3.2.4 黑龙江林蛙 黑龙江林蛙2条序列比对后序列长度为658 bp，平均GC量为325，占49.4%。种内K2P距离为0.000。种内有无变异位点，见图2。

3.3 NJ树聚类分析

利用MAGA 7.0软件将所测序列与GenBank下载的序列构建NJ系统聚类树，见图3。4种林蛙的序列与勐腊水蛙和大绿臭蛙的序列分别聚为一支，从GenBank下载4种林蛙的序列与实验所测4种林蛙的序列分别聚为一支，说明DNA条形码技术不仅能够鉴别4种林蛙，也能够鉴定4种林蛙。东北林蛙和中国林蛙的雌雄个体并没有聚为两支而是聚在一支上，说明DNA条形码技术并不能鉴别林蛙的雌雄。辽宁（桓仁、清原）、吉林临江和辽宁（凤城、岫岩、宽甸）地区的东北林蛙分别聚为一支，上述东北林蛙COI基因序列在262，553位点分别有A/G，G/A变异且呈现地域性差异，说明东北林蛙COI基因可能存在地域性变异。

4 讨论

本实验前期采用哈蟆油作为样品，由于药材遇水膨胀后呈黏糊状[11]，利用SDS碱裂解法、苯酚法、试剂盒等方法均不能从哈蟆油中提取COI基因，故本次实验的所有样品均来自林蛙的肌肉组织。

通过对中国林蛙种组（中国林蛙、东北林蛙）和黑龙江林蛙种组（黑龙江林蛙、桓仁林蛙）的4个物种59份样品的COI基因序列进行比对分析，得到中国林蛙和桓仁林蛙的种间遗传距离为0.022与东北林蛙和黑龙江林蛙的种间遗传距离均大于0.080，说明中国林蛙和桓仁林蛙的亲缘关系更近，与传统的林蛙分类学将4种林蛙分为2个种组存在一定的矛盾。由于物种的基因更能说明物种之间的亲缘关系，DNA条形码技术在动物分类学上的应用有助于现代动物分类学更快的发展。

通过对3个省8个市的125份样品提取总DNA并进行PCR、测序，同一试剂盒对4种林蛙的提取成功率有很大的差别，中国林蛙和桓仁林蛙的PCR成功率为100%，东北林蛙PCR成功率为49.3%，黑龙江林蛙PCR成功率为6.7%。本实验对黑龙江林蛙的PCR条件进行多次优化，其PCR成功率依然较低，应考虑选择不同的试剂盒进行提取。线粒体COI基因位于细胞质内，属于母系遗传，本次实验对中国林蛙和东北林蛙的雌雄的COI基因进行测序，其基因序列并不能鉴别林蛙的雌雄，验证了该理论。中国林蛙、桓仁林蛙、东北林蛙、黑龙江林蛙的种内变异的个数分别为1，0，7，0个，说明同一物种在同一地区其COI基因变异性较小；但东北林蛙种内的2个变异位点呈现地域性差异且本次实验的两个地域变异位点较为稳定，辽宁岫岩、凤城、宽甸聚为一支，辽宁桓仁、清原和吉林临江聚为一支，可能是由于长期的地理隔离，东北林蛙的线粒体COI基因发生了稳定性的变异。对于不同地域的东北林蛙的碱基变异是否具有稳定性，还需要进一步研究。本次实验，基于COI序列的DNA条形码技术准确鉴定了哈蟆油基的原动物，为鉴定哈蟆油基原动物提供新的手段和方法。

[参考文献]

[1] 中国药典.一部[S].2015：255.

[2] 金莉莉，王磊，杨传熙，等.基于16SrRNA 和POMC基因序列的中国北方林蛙属动物系统发生关系[J].辽宁大学学报：自然科学版，2012，39（3）：193.

[3] 谢峰，叶昌嫒，费梁，等.中国西北地区中国林蛙各居群的分类学研究[J].动物分类学报，2000，25（2）：228.

[4] 谢峰，叶昌媛，费梁，等.中国东北地区林蛙属物种的分类学研究[J].动物分类学报，1999，24 （2）：224.

[5] 魏刚，陈服官.中国林蛙R.chensinensis系统发育及物种形成和分化的研究[J].动物学报，1990，36（1）：76.

[6] 费梁，胡淑琴，叶昌媛，等.中国动物志.下卷[M].北京：科学出版社，2009：1010.

[7] 李宜平，晋纲，刘淼，等.哈蟆油动物基原问题探究[J].中国中药杂志，2003，28（1）：15.

[8] 杨同桂， 金毓黻. 沈故[M]. 沈阳：辽海书社， 1934.

[9] 陈士林.中国药典中药材DNA条形码标准序列[M].北京：科学出版社，2015：40.

[10] 辛天怡，雷美艳，宋经元.中药材DNA条形码鉴定研究进展[J].中国现代中药，2015， 17（2）： 170.

[11] Chen S， Pang X， Song J， et al. A renaissance in herbal medicine identification： from morphology to DNA[J]. Biotechnol Adv， 2014， 32（7）：1237.

[12] 周美玉，陈骁，杨圣云.采用DNA条形码技术对厦门海域鱼卵、仔稚鱼种类的鉴定[J].海洋环境科学，2015，34（1）：120.

[13] 陈士林.中国药典中药材DNA条形码标准序列[M].北京：科学出版社，2015： 335.

[14] 廖婧.华南地区常见药用蛇类的DNA条形码研究及其在金钱白花蛇鉴定上的应用[D].广州：南方医科大学，2013.

[15] 杜鹤，孙佳明，崔丽娜，等.基于COI条形码的麝香及其混伪品的DNA分子鉴定[J].吉林中医药，2011，31（5）：451.

[16] 闫晗.利用ISSR和COI序列标记分析不同地理仿刺参群体的遗传多样性[D].沈阳：辽宁师范大学，2006.

[17] 陈仕江，鲁增辉，廖玉凤，等.7种中药材斑蝥COI基因序列的分子系统学研究[J].西南农业报，2013，26（5）：1809.

[18] 贾静，石林春，陈士林，等。市售鹿茸粉药材的DNA条形码鉴定[J].药学学报，2015，50 （10）： 1356.