聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体提取及HPLC测定

[摘要]目的：建立聚丙烯酰胺水凝胶(PAMG)中丙烯酰胺(AM)单体提取及检测的高效液相色谱(hplc)分析方法。方法：用水做提取剂对PAMG中的AM进行提取，采用Oasis HLB 6cc和Varian Bond Elut－Accucat固相萃取柱对样品进行纯化，以HPLC测定其含量。结果：未植入人体PAMG中AM含量为0.2－0.8μg/ml，从人体中取出PAMG中AM含量均低于最小检出限0.05μg/ml。结论：本方法适用于PAMG中AM单体含量的检测，具有操作简单、灵敏、准确等优点。

[关键词]聚丙烯酰胺水凝胶；丙烯酰胺；高效液相色谱

[中图分类号]R92 7 [文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)07－0888－03

聚丙烯酰胺水凝胶(PAMG)于1997年由乌克兰引入我国后，广泛应用于注射隆乳。而后由于出现移位、硬结、疼痛、无菌性炎症等多种术后并发症，国家食品药品监督管理局于2006年4月全面禁止医用PAMG在国内的生产与销售。有研究表明聚丙烯酰胺在多种条件下可以发生一定程度的降解，如光降解、热降解、化学降解、生物降解等，而人体组织是一种复杂的生物有机环境，因此考虑PAMG在人体中可能发生降解。由于合成PAMG的丙烯酰胺(AM)单体已被证明对人体具有神经毒性及可能的生殖毒性、致癌性，因此分析植入人体内PAMG中AM的含量就变得至关重要。

1　材料和方法

1．1　样品来源：从5位患者体内抽出的医用PAMG(奥美定，吉林富华医用高分子材料有限公司)；患者均为女性，2006年就诊于西京医院整形外科，因注射隆乳术后发生术后并发症要求手术取出植入物，年龄29－38岁，PAMG植入时间2－5年，并发症有单侧或双侧的疼痛、硬结、移位等，抽出物均为淡黄色、半透明、凝胶状颗粒。

1．2　仪器与试剂：HP1100型高效液相色谱仪(Agi－lent公司，美国)；AL204电子天平(上海梅特勒－托利多仪器有限公司)；BR4i高速台式离心机(Thermo Electro公司，美国)；MTN－2800D氮吹浓缩仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；Oasis HLB6cc (200mg)固相萃取柱(Waters公司，美国)：Bond Elut－Accucat (mixed mode，C8，SAX andSCX)3ml固相萃取柱(Varian公司，美国)；大旋转过滤管，0.45txmPVDF(Alltech公司，美国)；SKY－100B恒温培养摇床(上海苏坤实业有限公司)。丙烯酰胺(99.5％，优级纯，陕西中美生物科技有限公司)；甲醇(色谱级，Fisher scientific公司，美国)。

1．3　提取及净化方法：准确称取0.1g医用PAMG产品于15ml离心管中(从人体取出的PAMG需称取1g，原因见结果与讨论)，加入蒸馏水至10ml，置于37℃恒温培养摇床中振荡72h后，取出离心(9000r/min)30min，取上清液2ml，经0.45μm滤膜(9000r/min)离心过滤5min，使液体完全通过滤膜；然后取1.5ml分别经Oasis HLB 6cc和Varian Bond E－lut－Accucat同相萃取柱(使用前均需活化)萃取净化，最终得到1ml洗脱液；经氮吹仪吹干后加入50μl蒸馏水重新溶解，供液相色谱测定。

1．4　HPLC分析条件：色谱柱：Angilent TC－C18，4.6mm×150mm，粒度5μm；流动相：100％水；流速1ml/min；柱温为室温；检测波长210nm；进样量20μl。

2　结果与讨论

2．1　检测方法的选择：近年来在食品行业中，由于食品中的AM含量受到全世界的广泛关注，目前已经建立了多种微量AM的提取及检测方法，主要有GC－MS/MS，LC－MS/MS等，这些检测方法的特点是成本高、操作复杂；另外，PAMG大分子的交联结构决定了它无法溶于水，从而导致对其分子结构的分析方法有限，也使得提取PAMG中可能含有的AM单体比较困难。因此，本实验采用高效液相色谱(HPLC)来检测PAMG中的AM，HPLC是一种常规的化合物检测方法，特点是操作简便、参数易于调整、经济适用，有利于PAMG中AM提取条件的摸索。国内已有部分学者用HPLC对PAMG中的AM进行了提取及检测，但这些方法存在一些不足，如AM的提取过程复杂、HPLC图杂质峰较多等，且从人体中取出的PAMG由于与体液进行交换而含有多种复杂化学成分，影响AM的纯化。本文借鉴食品中AM的提取方法，摸索适合于PAMG中AM的提取及检测方法。

2．2　样品称取量的确定：由于医用PAMG产品仍可吸收大量水而继续溶胀，0.1g样品在10ml水中可以溶胀饱和，形成凝胶、水混合体系；而从人体取出的PAMG吸水性已大大降低，为使其检测浓度较高，称取1g样品即可与10ml水形成凝胶、水混合体系，因此二者称取量有所区别。

2．3　提取方法的选择：由于聚丙烯酰胺是一种三维网状结构的多聚体，医用PAMG含水量超过95％，仍可吸收大量水溶胀成饱和的凝胶体，而AM极易溶于水，因此如何将AM从PAMG中完全提取出成为关键。过去曾采用水做提取剂，然而需通过大量水浸泡较长时间，使大多数AM分布到水相中，并多次进行此过程，收集每一步的水相并浓缩完成提取过程，这种方法耗时较长。也有用甲醇做提取剂，PAMG不溶于甲醇，AM可随水从PAMG中提出溶于甲醇，然而加入甲醇后，PAMG立即固缩为白色固体，阻止了AM扩散到甲醇中，尽管在提取过程中不断搅拌，以及经超声或振荡，可以增加AM的提取量，但回收率仍不理想，且提取液需经多次转移，过程中AM损失较多。而本法经过实验验证PAMG与水混合恒温振荡72h，可认为AM在水相和凝胶相中分布趋于均匀，然后取一定量的水相进行处理检测，结果通过比例关系可推算出全部AM的量。本法处理步骤少、操作简单、回收率高是其优点。

2．3　净化方法的选择：在提取丙烯酰胺的过程中，特别是从人体取出的样品，不可避免地会将人体体液内的某些有机和无机成分一起提取出来。这些内源性杂质如果不经过净化处理，在进入HPLC检测时，可能会堵塞色谱柱，影响其使用寿命，而且可导致色谱图干扰峰较多，基线不稳定，影响检测结果，所以必须通过净化处理来去除这些杂质。本实验所选用的Oasis HLB和Bond Elut－Accucat固相萃取柱，是美国FDA公布的食品中检测丙烯酰胺标准方法中所采用的固相萃取柱。通过实验证明联合应用两种固相萃取柱，可以快速、有效地去除提取液中的杂质，色谱峰形好，基线平稳，杂质峰干扰少，定量准确。

2．4　方法确证

2．4．1　标准曲线的绘制：准确添加AM标准溶液至未植入人体的PAMG中，使其最终浓度分别为0.05、0.5、1.0、10、50、100μg/m1，按1.3节的方法进行样品处理，在所选择的色谱条件下进样，结果表明，当AM含量为0.05μg/ml－100μg/ml时，AM峰面积(y)和AM含量(μg/ml)呈良好的线性关系，线性方程为：y＝122.59x－18.398，相关系数R2＝0.9997。

2．4．2　方法检测限：取低浓度丙烯酰胺标准溶液，用水逐级稀释并进样测定，以信号噪声比(S/N)等于3为基准，测得该条件下丙烯酰胺的最小检测限为0.05μg/ml；以信号噪声比等于10为基准，测得丙烯酰胺的最小定量限为0.15txg/ml。

2．4．3　精密度试验：取0.2、1、5μg/ml的丙烯酰胺标准溶液分别代表低、中、高浓度，各浓度溶液分别连续进样6次，计算得到三个浓度测定数值的相对标准偏差(RSD)分别为4.7％、3.3％和2.4％。取聚丙烯酰胺水凝胶样品一份，按优化后的方法进行样品处理，于1天内的6个不同时段进行HPLC分析；同时，分8天连续测定，取平均值并计算RSD值。其日内和日间RSD值分别为5.6％和6.7％。

2．4．4　加样回收率：对3瓶医用PAMG产品，各取3份按1.3节的方法进行样品处理并行HPLC检测；再各取3份按上步检测得到的浓度由低到高，分别添加AM标准溶液0.2、1.0、5.0μg/ml，用同样方法进行处理、HPLC测定，得平均回收率＞87％。

2．5　样品测定：对未植入人体的5份PAMG样品进行检测，结果为0.2－0.8μg/ml；对从人体中取出的5份PAMG样品进行检测，结果均低于最小检出限。

2．6　结论：本研究建立的方法较其他方法步骤少、操作简单、回收率高，适用于PAMG中AM单体含量的检测。对植入与未植入人体PAMG的检测结果提示，植入人体的PAMG在人体内未大量降解及局部蓄积，且AM含量低于植入前水平，可能因为PAMG中的水分在人体组织复杂的生物环境中与体液进行交换，AM自由扩散，被组织吸收、代谢使之含量减少。对于临床出现的多种并发症，可能不是残留单体单独作用的原因，可能与其他因素有关。因此，对于其可能含有的其他化学成分，以及水凝胶大分子结构的微观变化及其长期的变化仍需进一步探讨。由于对从人体中抽出PAMG中的AM检测结果均低于最小检出限，所以有待于对AM更低浓度的检测方法的建立。