实时定量PCR法检测巨细胞病毒感染与传统抗原检测法的比较

摘要：目的 对比实时定量PCR法与抗原检测法检测全血样品巨细胞病毒（CMV）感染的差异。方法 采自79例患者的479份全血样本，分别应用CMV DNA PCR法和CMV抗原检测法进行测试，结果进行比对。其中13例患者应用更昔洛韦进行抗病毒治疗，在治疗前后反复采血，对比两种检测方法在治疗监测方面的差异。结果 13例抗病毒治疗患者中，PCR法可更早检测到病毒感染，治疗后PCR法病毒转阴时间长于CMV抗原检测法。结论 全血样本CMV DNA PCR法检测，敏感度较高，是一种检测CMV感染的有效工具。

关键词：巨细胞病毒；实时定量PCR；抗原检测试验

Real Time Quantitative PCR Method and the Comparison of the Detection of Cytomegalovirus Infection by the Traditional Method

SHI Xiao-ying，LI Min-lu，HUANG Wei，DENG Chun-fa

（Dongxihu District Center for Disease Control and Prevention，Wuhan 430040，Hubei，China）

Abstract：Objective To compare the efficacy of use of real-time PCR for quantitation of Cytomegalovirus（CMV）DNA in whole blood with the antigenemia assay. Methods 479 whole blood samples from 79 patients， falling under different disease groups， were tested by real-time CMV DNA PCR using the Q-CMV real-time complete kit and CMV antigenemia assay， and the results were compared. Repeatedly tested patients were selected and their charts were reviewed for ganciclovir therapy. Results The 13 patients were transplant recipients and treated with ganciclovir. Before treatment， CMV was detected earlier by real-time CMV DNA PCR than the antigenemia assay. After treatment， the antigenemia assay achieved negative results earlier than real-time CMV DNA PCR. Conclusion Q-CMV real-time complete kit is a useful tool for early detection of CMV infection in whole blood samples .

Key words：Cytomegalovirus； Real-time quantitative PCR； Antigen detection test

巨细胞病毒（CMV）主要发生于实质器官抑制和骨髓移植的患者中，直接影响器官移植的效果，因此早期诊断治疗CMV感染意义重大[1]。目前用于诊断CMV感染的技术包括：病毒培养、抗原检测、杂交试验、定量或半定量PCR检测等[2]。CMV pp65抗原检测是一种免疫荧光试验，通过间接免疫荧光技术鉴别外周血白细胞表面的pp65蛋白，这种蛋白常于CMV感染后表达。实时定量PCR技术检测CMA DNA的优点在于较高的敏感度和简单的操作流程[3]。Q-CMV 实时定量PCR试剂盒 （Nanogen公司）是与CMV抗原检测试验进行对比，通过分析不同人群的试验结果，探讨应用实时定量PCR方法检测全血CMV DNA在临床检测中的特点。

1资料与方法

1.1一般资料 对2012年～2014来我院检查的79例患者进行回顾性研究。在反复检测的患者中，回顾更昔洛韦抗病毒治疗的有效性。EDTA抗凝静脉血样本被收集，应用于抗原检测试验和实时定量PCR试验。

1.2 CMV pp65抗原试验 在样本收集4h内进行抗pp65原检测试验，应用CINA试剂盒系统（ArgeneBiosoft公司，法国）。全血细胞离心涂片，细胞量控制在2×105个/玻片，常规固定、透膜。按照试剂盒流程，应用CMV pp65 单克隆抗体检测 CMV pp65 抗原的表达，应用荧光二抗进行检测。

1.3全血CMV DNA 实时定量PCR检测 实时定量PCR法检测CMV DNA与CMV抗原检测同步进行，应用Q-CMV实时定量PCR试剂盒，按照试剂盒操作规程实施。试剂盒主要通过扩增CMV外显子4区域的主要立即早期抗原HCMVUL123，检测CMV DAN；β-globin 作为内参。应用QIAamp DNA blood mini kit在200μL全血中提取CMV DNA。5μL DNA样本和20 μL反应混合物加入微板孔中，以无菌水作为阴性对照。PCR条件为：预变性95°C 10 min；变性95°C 15s，退火60°C 1 min，45个循环。应用CFX96实时定量系统，检测阈值为最低65 拷贝/mL，试验中检测CMV DNA的线性范围从790到5×106拷贝/mL。

1.4 CMV感染和CMV疾病的诊断标准 CMV疾病的诊断标准为，具有临床症状：不明原因的发热，白细胞

1.5 统计分析 应用MedCalC和SPSS 16.0软件进行数据分析。

2结果

2.1 CMV DNA PCR法与CMV抗原检测定性结果的比较 479个样本取自79例患者，其中29例患者检测一次，50例患者反复进行检测。检测样本结果如下表1。

2.2 CMV DNA PCR法与CMV抗原检测定量结果的比较 应用Pearson相关性分析，分析显示两种方法间存在中等的相关性（r=0.5504，P

图1 实时定量PCR法与抗原检测法的相关性分析。

Pearson相关性分析显示，两种方法间存在中等的相关性（r=0.5504，P

2.3 CMV DNA PCR法与CMV抗原检测法对临床治疗的评估 13例CMV患者应用更昔洛韦进行抗病毒治疗，进行反复的病毒检测。首次检出CMV阳性的时间（中位时间），CMV DNA PCR法为15.5d（0～56d）；CMV 抗原检测法23.5d（8～252d）。治疗前，检测患者病毒中位载量为2716拷贝/mL（

3讨论

CMV抗原检测和CMV DNA PCR广泛被应用于CMV的首次感染、再燃和早期CMV治疗[3]。然而，针对不同患者群体，不同机构对于临床诊断CMV感染的阈值均不统一。

我们证实两种方法在检测全血样本时一致性高达86.4%，这与同类研究结果一致。但两种检测方法间仍存在差异，在65例差异样本中，61例（93.8%）是CMV DNA PCR阳性结果，而抗原检测为阴性，而这61例中45例的检测结果低于荧光定量的线性区间（

总之，应用Q-CMV实时定量试剂盒检测CMV感染，与抗原检测法具有良好的相关性，且更加敏感，可以被应用于早期的CMV感染检测，并应用于指导治疗。

参考文献：

[1]Paya CV. Prevention of cytomegalovirus disease in recipients of solid-organ transplants[J].Clin Infect Dis，2001，32：596-603.

[2]Boeckh M and Boivin G. Quantitation of cytomegalovirus： methodologic aspects and clinical applications[J].Clin Microbiol Rev，1998，11：533-554.

[3]Paya CV， Wilson JA， Espy MJ， et al. Preemptive use of oral ganciclovir to prevent cytomegalovirus infection in liver transplant patients： a randomized， placebo-controlled trial[J].J Infect Dis，2002，185：854-860.