Toll样受体1基因多态性与华北地区汉族人群支气管哮喘关系的研究

[摘要] 目的 探讨Toll样受体1（TLR1）基因外显子3区的单核苷酸多态性（SNP）与华北地区汉族人群支气管哮喘之间的关系。 方法 选取山东省潍坊市人民医院（以下简称“我院”）呼吸科2014年1月～2015年1月收治的支气管哮喘患者100例为哮喘组，选取同期在我院健康查体100例为对照组，采集外周血并提取全基因组DNA。采用聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线（PCR-HRM）技术和DNA测序技术检测TLR1外显子3区的基因多态性。比较哮喘组和对照组等位基因和基因型的分布差异。 结果 哮喘组与对照组TLR1基因SNP的rs5743596分布差异无统计学意义（P > 0.05）。哮喘组与对照组等位基因C和T的分布频率差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 TLR1基因rs5743596位点的多态性与支气管哮喘易感性之间关系不大。

[关键词] Toll样受体1；单核苷酸多态性；高分辨率熔解曲线技术；支气管哮喘

[中图分类号] R562.2+5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（b）-0017-04

Association analysis between polymorphism of Toll-like receptors 1 and susceptibility to asthma of Han people in North China

XU Wenyuan1 DING Zhaolei2 XU Zhen3 SHENG Jianhui1 TAN Wei2

1.Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261042， China； 2.Department of Respiratory Medicine， People′s Hospital of Weifang City， Shandong Province， Weifang 261041， China； 3.Department of Surgery， Maternal and Child Health Hospital of Ningyang County， Shandong Province， Ningyang 271400， China

[Abstract] Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphisms （SNP） of excon-3 in Toll-like receptors 1 （TLR1） and susceptibility to asthma of Han people in North China. Methods 100 patients with asthma treated in Respiratory Department， People′s Hospital of Weifang City in Shandong Province （"our hospital" for short） from January 2014 to January 2015 were selected as asthma group， in the same period， 100 cases with kindergarden in our hospital were selected as control group. DNA samples were taken from their peripheral blood. Polymerase chain reaction-high resoution melting （PCR-HRM） technique and DNA sequencing technique were employed to detect the polymorphisms of excon-3 in TLR1. And meanwhile， distribution of allele and genotype between asthma group and control group were measured. Results There was no statistical difference in the distribution of TLR1-rs5743596 between asthma group and control group （P > 0.05）. There were no statistical significantly differences in the allele frequencies of C and T between asthma group and control group （P > 0.05）. Conclusion The rs5743596 of TLR1-SNP may not be involved in the susceptibility to asthma.

[Key words] Toll-like receptors 1； Single nucleotide polymorphism； High resolution melting technique； Asthma

支气管哮喘（简称哮喘）是一种以气道高反应性和多种炎症细胞（中性粒细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞等）浸润为特征的气道慢性炎症。据世界卫生组织统计，目前患哮喘人数高达2.35亿人[1]。哮喘的患病率不断增长，有人提出哮喘的发生与吸烟、肥胖、过敏性疾病、暴露于颗粒物有密切的联系[2-4]。哮喘的发病机制已逐渐受到人们的关注。

免疫学研究认为，机体在遗传基础上受到外界刺激物影响时，外周血中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞等可通过分泌细胞因子，导致Th1/Th2比列失衡，从而导致哮喘的发生[5]。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为新近发现的细胞跨膜受体，他们主要分布于单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）等多种免疫细胞表面[6]。

近年来，TLRs单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与哮喘的关系备受关注。研究结果显示，Toll样受体2（Toll-like receptors 2，TLR2）、Toll样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）、Toll样受体6（Toll-like receptors 6，TLR6）、Toll样受体9（Toll-like receptors 9，TLR9）、Toll样受体10（Toll-like receptors 10，TLR10）的基因多态性可能与哮喘或特应性体质有关[7-11]。但有关Toll样受体1（Toll-like receptors 1，TLR1）基因多态性与哮喘关系的研究，目前国内几乎空白。本文通过对哮喘与TLR1外显子3区基因多态性的研究，旨在探讨哮喘与TLR1基因rs5743596位点多态性之间的关系，对哮喘的预防及早期治疗做进一步指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取山东省潍坊市人民医院（以下简称“我院”）呼吸科2014年1月～2015年1月收治，能够留取血标本并自愿参与实验的成人哮喘患者100例作为哮喘组，其中男67例，女33例；平均年龄（50.44±19.21）岁。诊断标准参考中华医学会呼吸病学分会哮喘学组所制订的支气管哮喘防治指南。剔除标准[12]：①合并其他呼吸系统疾病，如慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张等；②诊断为良性或恶性肿瘤；③有真菌、病毒、寄生虫感染者；④明确伴有自身免疫性疾病等。另选取同期在我院健康查体并取得知情同意后的健康成人志愿者100例作为对照组，其中男56例，女44例；平均年龄（48.26±17.59）岁。两组研究对象均为华北地区汉族人群，且均无血缘关系。两组的性别、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 样本选取 每位受试者抽取空腹静脉血2 mL，枸橼酸钠抗凝，置于-20℃保存备用。

1.2.2 DNA基因组提取 按照DNA提取试剂盒所示步骤提取所有样本的DNA。通过电泳鉴定DNA提取成功，通过Nanodrop2000微量紫外分光光度仪测定提取基因组DNA的浓度和纯度，终浓度4.5～5.5 ng/μL，纯度OD260/OD280为1.8～2.0。-20℃保存备用。

1.2.3 引物设计 在NCBI的数据库查找TLR1人的DNA序列和RNA序列信息，根据外显子序列区域利用软件Primer 5.0设计相关引物，引物设计本着分段重复、覆盖的设计原则，设计的引物最后采用Oligo7.0验证引物的特异性及稳定性，并送至公司合成引物，正向引物为5′-CCTTGCTCAGGGTCTTCATG-3′，反向引物为5′-CTTACCCTTTTGTAGGGGTGC-3′。

1.2.4 运用高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）进行基因分型 采用HRM技术扩增基因组DN段并进行基因分型，获得HRM分析结果，从而判定样品的SNP类型。实验所用试剂Light Cycler⑧480 High Resolution Melting Master购自罗氏公司。标准品的制备及PCR-HRM反应总体系：标准品由前期测序直接获得。总体积20 μL，其中HRM Master 10 μL、正反向引物各1 μL、全基因组DNA 3 μL、MgCl2 1.6 μL、去离子水3.4 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性120 s，然后94℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，共55个循环。在进行HRM分析之前，进行变性和复性处理，反应条件如下：95℃ 60 s，54℃ 10 s。HRM过程从54℃开始，以1℃/s的斜率采集熔解曲线，到95℃结束，并在Light Cycler 480基因扫描软件模块上进行分析。每次反应均需将已知基因型的标准品与待测样本同时进行检测。根据HRM的形状判断基因型，与标准品曲线形状相同者被认定为与标准品基因型相同，从而获得未知待测样品的基因型。

1.2.5 测序验证 用DNA测序结果验证HMR检测结果的准确性，通过PCR技术扩增TLR1基因中包含rs5743596位点的DN段，扩增片段经过纯化后直接用于测序分析。随机抽取30份PCR产物进行测序，由上海立菲生物技术有限公司完成。PCR扩增用引物，正向引物为5′-TTTCCGGGTCTTTCAGCC-3′，反向引物为5′-AAGCACCAAATTCCTCTTCACA-3′，PCR扩增体系为：总体系50 μL，其中正反向引物各2 μL、全基因组DNA 5μL、Taq酶25 μL、去离子水16 μL。反应条件：94℃预变性5 min，然后94℃变性45 s，64℃退火1 min，72℃延伸45 s，共40个循环，最后72℃延伸5 min。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HRM分析

图1A（封三）为TLR1基因标准熔解曲线，图1B（封三）为标准化的温度变化曲线，代表不同基因型熔解曲线的形状和颜色，因温度的变化发生改变，结合不同熔解曲线样本经测序的结果（图2），其中绿色表示杂合子突变型CT，蓝色表示纯合子突变型TT，红色表示野生型CC。测序结果通过查阅NCBI和GenBank发现该突变位点位于TLR1基因的rs5743596位点。

A：野生型CC基因型的测序结果，黑色箭头指向C等位基因；B：纯合子突变型TT基因型的测序结果，箭头指向T等位基因；C：杂合子突变型CT基因型的测序结果，黑色箭头指向CT杂合基因

图2 不同熔解曲线样本经测序的结果

2.2 遗传平衡检验

哮喘组人群TLR1基因rs5743596位点的基因型频率比较，差异无统计学意义（χ2=1.013，P=0.310）；对照组人群TLR1基因rs5743596位点的基因型频率比较，差异无统计学意义（χ2=3.630，P=0.056）。哮喘组和对照组中该位点的基因型频率无显著性差异，证明符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，本研究人群具有群体代表性。见表1。

表1 遗传平衡检验

2.3 哮喘组和对照组各基因型和等位基因分布频率比较

哮喘组TLR1基因rs5743596位点的各基因型与对照组比较，差异无统计学意义（χ2=4.988，P=0.083）；哮喘组与对照组TLR1基因rs5743596位点的等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（χ2=0.604，P=0.437）。见表2。

表2 哮喘组和对照组各基因型和等位基因分布频率比较[n（%）]

3 讨论

TLRs是近年来研究的热点，Koponen等[13]、袁欣等[14]认为，TLRs在先天性免疫系统中起重要作用，TLRs基因的表达与哮喘等自身免疫性疾病有密切关系。哮喘是一种复杂的多因素疾病，基因-环境在哮喘的发病中起重要作用，遗传因素可以引起TLRs基因的多态性[15]，而环境因素又可以通过TLRs调节Th1/Th2平衡[16]，从而影响哮喘的发病。Hussein等[17]、Werner等[18]发现，TLRs基因（主要为TLR2和TLR4基因）编码的改变，可以增加哮喘患病的危险性。所以进一步研究由遗传因素决定的TLRs多态性与哮喘之间的关系问题，对于明确哮喘的发病机制以及治疗方法具有非常重要的意义。目前TLR2、TLR4等亚家族基因多态性与哮喘的研究已成为众多实验研究的热点，而对于TLR1的研究国内外尚未完善。

TLR1位于人基因组4p14，长度为8537 bp，有4个外显子区（exon），分别位于-5960～-5923、-5551～-5475、-2117～-2026、-67～2576。TLR1作为TLRs的亚家族，表达于多种免疫细胞受体，在免疫应答和感染中起重要作用，与哮喘炎症及气道重塑关系密切[19-20]。我国人群中，对于TLRs SNP与哮喘关系的研究尚未开展，为了进一步了解哮喘的发病机制，有必要对我国人群哮喘相关的TLRs SNP进行筛选。本实验着重研究外显子片段3的SNP位点与哮喘的关系。

本研究对哮喘组患者的TLR1外显子3进行测序研究，发现一个SNP，位于rs5743596位点的C突变为T，经过χ2检验，差异无统计学意义，说明此位点的等位基因分布频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。TLR1基因rs5743596位点在我国华北地区汉族人群中存在，且存在3种基因型，分别为CC、CT、TT型。本实验结果显示，与对照组比较，哮喘组TLR1基因位点rs5743596基因型分布以及等位基因的分布频率差异无统计学意义（P > 0.05），因此rs5743596位点的SNP与哮喘易感性之间关系不大。但是不同人群之间等位基因分布频率差异较大，本研究仅局限于中国华北地区汉族人群，有可能导致该结果并不适用于其他地域或种族人群；其次，对于TLR1基因的其他SNP位点是否与哮喘的发生相关，仍需进一步研究。本研究首次对华北地区人群TLR1基因的多态性与哮喘关系进行了探讨，它将为今后在汉族人群中开展TLR1基因的多态性与哮喘及其他疾病相关性的研究奠定基础。

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（收稿日期：2015-10-24 本文编辑：李亚聪）