TAG—1与神经干细胞分化的相关性研究

[摘要] 目的 研究微环境蛋白tag-1与神经干细胞分化之间的关系。 方法 使用免疫荧光染色检测神经干细胞中巢蛋白nestin的表达，并过表达TAG-1后使用实时荧光定量PCR技术分析神经干细胞中分化相关蛋白的表达变化。 结果 体外培养的神经干细胞中过表达TAG-1以后，干性相关基因nestin和转录因子SOX2 （SRY-box2）表达降低，神经元标志物神经元微管蛋白β Ⅲ（neuronal class Ⅲ β-Tubulin，Tuj1）和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达升高。 结论 TAG-1可能与神经干细胞的分化存在正相关的关系，其分子调节机制有待进一步研究。

[关键词] TAG-1；神经干细胞；分化

[中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（c）-0012-03

近年来，神经干细胞（neural stem cells，NSCs）替代疗法已被用于研究神经系统功能缺陷性疾病的治疗，如脑外伤、脑缺血、出血、帕金森病、老年性痴呆等，但其效果一直欠佳[1]。NSCs的自身内源性因素及所处的微环境调节了干细胞的增殖，决定着神经元的发生、存活、分化，是影响细胞替代疗法应用的关键。研究表明，细胞黏附分子TAG-1表达于多种神经元和胶质细胞，与神经元轴突生长相关，参与神经发生和微环境的调节[2-3]。本试验探讨体外培养成年小鼠脑室下区（subventricular zone，SVZ）NSCs是否表达微环境蛋白分子TAG-1，并探索其对NSCs分化的影响，为将来更有效的NSCs的替代疗法奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

实验用动物为2～4个月大的昆明小鼠，体重20～25 g，由南方医科大学实验动物中心提供。细胞培养所需的DMEM/F12培养基、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、胰酶等均购自Invotrogen公司；兔来源TAG-1抗体购自Sigma公司，HRP标记二抗购自Santa Cruz，Hochest 与nestin抗体购自Abcam，荧光二抗购自Invitrogen公司，TAG-1慢病毒及对照由百诺生物公司提供，逆转录试剂盒购自Fermentas公司，Trizol与实时定量PCR试剂盒购自takara，PCR仪使用biorad C1000，荧光显微镜为德国Leica公司生产。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的分离和培养 对昆明小鼠用1.5%戊巴比妥钠0.1 mL/20 g麻醉，在无菌条件下取出侧脑室下区外侧壁，置于预冷的磷酸酶消化液（PBS）中。加入胰酶消化并轻轻将组织吹打成小块，在37℃下孵育10 min，期间多次吹打混匀，使组织消化成单个细胞。加入NSCs完全培养基终止消化，常温3000 r/min离心3 min。弃上清，加入培养基洗涤一次，再次以3000 r/min 离心3 min。弃上清，加入培养基轻轻重悬细胞，移入培养瓶中培养。NSCs完全培养基为DMEM/F12（1∶1），每50毫升中添加青霉素-链霉素500 μL，N2 500 μL，B27 1 μL，bFGF 20 μg/L，EGF 20 μg/L，携带TAG-1的慢病毒感染。对照组使用未携带质粒的病毒进行感染，感染复数（MOI）值=20，感染后3 d收集细胞。

1.2.2 免疫荧光 细胞预先接种于包被了多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的玻璃片上，取出培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）轻洗2次。用4%多聚甲醛室温下固定15 min。用PBS漂洗（5 min×3次），用10%山羊血清在室温下封闭1 h；加一抗nestin（1∶300），4℃下孵育过夜。用PBS漂洗（5 min×3次），加相应的二抗室温孵育1 h。用PBS漂洗（5 min×3次），封片，在荧光显微镜下观察。

1.2.3 Western blot 在冰上用RIPA缓冲液提取蛋白，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的蛋白转移至多氯二苯呋喃（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入TAG-1抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜（5 min×3次），加入相应标记的HRP二抗，室温孵育2 h。TBST洗膜（5 min×3次），ECL化学发光法显影。

1.2.4 SYBR Green实时定量PCR技术 Trizol法提取RNA，逆转录使用fermentas逆转录试剂盒。Real time PCR试剂盒购自天根生化公司，按说明书操作。采用Sybr Green两步法，95℃ 15 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。使用引物见表1。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，Western blot结果扫描灰度值以后与GAPDH的比值计算，实时荧光定量PCR结果以2-Ct法分析目的基因与GAPDH的相对表达量，并进行t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经干细胞体外培养及鉴定

取成年小鼠脑室下区细胞进行体外培养8 d，只有少量单个细胞存活，并生长成神经球，在培养基中悬浮生长。使用免疫荧光染色标记，发现形成神经球的细胞大多数呈nestin阳性，这些细胞被认为是具有多潜能性的神经干细胞。见图1。

2.2 TAG-1在神经干细胞中的表达

Western blot结果显示，TAG-1过表达组与对照组相比，表达量显著增加（P < 0.05）。见图2。

2.3 TAG-1过表达后相关基因的表达

使用实时荧光定量PCR检测相关基因的表达。与对照组相比，过表达TAG-1的神经干细胞中，神经干细胞标志物nestin和SOX2表达降低，胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和神经元标志物神经元微管蛋白βⅢ（neuronal class Ⅲβ-tubulin，Tuj1）表达量增加（P < 0.05）。见图3。

3 讨论

Reynolds等[4]从成年小鼠纹状体中分离出能在体外不断分裂增殖，具有自我复制、自我更新及多向分化潜能的一类细胞群，提出了NSCs的概念。将这些NSCs进行体外培养，它们能够分化，产生神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞。近年来发现成年体内NSCs，主要存在于成年SVZ和海马的颗粒层下区（subgranular zone，SGZ），并且它们能够分化为神经元，分别整合到嗅球和海马的神经元通路中去[5-6]。许多动物实验已证明NSCs移植治疗神经系统功能缺陷性疾病的可行性。然而，在成年脑内神经干细胞数量有限，而且这些干细胞所分化产生的新神经元发育成熟率低，而且许多新产生的神经元存活期很短[7]。多年来的干细胞研究表明，NSCs的生物特点和自身内源性因素及所处的微环境密切相关。SVZ和SGZ的干细胞受其所处的微环境调节，除了调节干细胞的数量，同时还决定着神经元发生、存活。相较于胚胎神经干细胞，成年体NSCs更加容易获取，而且成年神经功能缺陷疾病远多于胚胎，而且治疗更加困难。因此，对干细胞自身内源性因素和所处的微环境的了解，尤其是成年个体，它们在干细胞增殖、分化中的作用、病理变化下的改变及对干细胞行为的影响是对NSCs生物行为的理解的关键，也是将来细胞替代疗法应用的关键。

TAG-1是一种细胞黏附分子，属于免疫球蛋白超家族的接触蛋白亚科的一种[8]，主要在发育的中枢神经系统和外周神经系统的一个神经元亚群中表达[9]，参与了轴突的重塑、神经元胶质细胞间相互作用以及胶质细胞的迁移[10]。胚胎发育过程中，调节细胞黏附，轴突外生长，轴突导向和形成高度顺序性神经连接[11-13]。最新研究发现，TAG-1表达于小鼠胚胎NSCs，是胚胎NSCs的微环境分子，在胚胎期可以通过APP/Fe65信号途径调节NSCs的神经元分化[14]。本研究也发现TAG-1表达于体外培养的成年小鼠SVZ区NSCs中，TAG-1的过表达可以上调Tuj1和GFAP的表达，降低干性基因nestin和SOX2的表达。该结果提示TAG-1参与了NSCs的分化过程，为将来可能的干细胞治疗提供实验依据，其作用机制和应用前景还有待进一步探索。

[参考文献]

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（收稿日期：2012-12-11 本文编辑：谷俊英）