巢式PCR检测梅毒螺旋体的应用分析

摘要：目的：探讨巢式pcr在梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）检测中的应用价值。

方法：本文采用巢式PCR检测梅毒螺旋体，并与常规PCR检测结果进行比较研究。

结果：半巢式polA PCR检测出阳性37例，阳性率达30.83%（37/120），常规polA PCR检测出阳性7例，阳性率达5.83%（7/120），经统计学分析发现半巢式polA PCR检测结果与常规polA PCR检测结果比较有显著性差异，差异具有统计学意义（X2=30.68，P=0.00）。这表明半巢式PCR灵敏度远高于常规PCR。

结论：半巢式polA PCR具有高度敏感、特异、标本处理简便等优点，适用于检测血清等标本中微量Tp，可作为血清学方法的补充用于梅毒诊断。

关键词：巢式PCR梅毒螺旋体

【中图分类号】R9【文献标识码】B【文章编号】1671-8801（2013）11-0538-01

我院于2008年9月～2010年9月采用巢式PCR检测梅毒螺旋体，并与常规PCR检测结果进行比较研究，为梅毒的预防和分子流行病学研究提供实验依据。

1资料与方法

1.1一般资料。本研究共收集2008年9月～2010年9月在120例可疑梅毒及有不洁性接触史的非梅毒患者的全血及相应的血清标本，其中男75例，女45例；年龄19～57岁，平均年龄（29.6±10.3）岁；入选的患者均自愿参加本次研究。

1.2方法。①标本收集：用KUBOTA 8410型和8420型离心机对血液标本离心，1800r/min、10min。试管离心后，在生物安全柜中开盖，整齐摆放在AT试管架上。吸取血浆放入离心管，闭盖，-20度保存，用于PCR检测[1]。②DNA模板制备：Tp用DNA Mini kit从兔培养物稀释液中提取模板；对照的微生物用DNA Mini kit从培养物中提取模板；临床血清标本分别用DNA Mini kit煮沸法提取模板。③引物设计：根据Tp polA基因序列（Genbank TPU57757），设计了4条引物，即P1：CGTCTGGTCGATGTGCAAATGAGTG，P2：CACAGTGCTCAAAAACGCCTGCACG，P3：TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC，P4：TGCACATGTACACTGAGTTGACTCGG。④常规PCR扩增polA基因：反应体系为25μL：1×PCR缓冲液（1.5moL/L MgCl2），dNTPs0.2mmol/L，引物P3和P2 0.5μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板2μL。反应条件：94℃ 5min；94℃ 15s，65℃ 30s，72℃ 45s，循环35次；72℃延伸5min。⑤半巢式PCR扩增polA基因：反应体系为25μL：1×PCR缓冲液（1.5moL/L MgCl2），dNTPs0.2mmol/L，引物0.5μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板2μL（外循环）或lμL（内循环）。反应条件：外循环以P1和P2为引物，94℃ 5min；94℃15s，56℃ 30s，72℃ 45s，循环20次；72℃延伸5min；内循环：以P3和P4为引物，94℃ 5min；94℃ 15s，56℃ 30s，72℃ 45s。循环30次；72℃延伸7min。

1.3统计学处理。使用SPSS13.0对各项资料进行统计、分析，计量资料以均值±标准差（X±S）表示，计量资料采用t检验，计数资料采用X2检验，P

2结果

由表2可知，半巢式polA PCR检测出阳性37例，阳性率达30.83%（37/120），常规polA PCR检测出阳性7例，阳性率达5.83%（7/120），经统计学分析发现半巢式polA PCR检测结果与常规polA PCR检测结果比较有显著性差异，差异具有统计学意义（X2=30.68，P=0.00）。这表明半巢式PCR灵敏度远高于常规PCR。

3讨论

梅毒（syphilis）是由密螺旋体属苍白螺旋体（Treponema pallidum，TP）的苍白亚种（又称梅毒螺旋体）引起的、对人类健康具有较为严重危害的一种性传播疾病[2]。直接检测梅毒螺旋体常用暗视野或免疫荧光染色镜检，但敏感性低且结果判断易受主观影响。聚合酶链反应（PCR）是检测Tp的有效方法[3]。本文采用巢式PCR检测梅毒螺旋体，并与常规PCR检测结果进行比较研究，结果发现半巢式polA PCR检测出阳性37例，阳性率达30.83%（37/120），常规polA PCR检测出阳性7例，阳性率达5.83%（7/120），经统计学分析发现半巢式polA PCR检测结果与常规polA PCR检测结果比较有显著性差异，差异具有统计学意义（X2=30.68，P=0.00）。这表明半巢式PCR灵敏度远高于常规PCR。

因此，半巢式polA PCR具有高度敏感、特异、标本处理简便等优点，适用于检测血清等标本中微量Tp，可作为血清学方法的补充用于梅毒诊断。

参考文献

[1]张永乐，章松平，马兰，等.检测早期梅毒螺旋体感染的4种方法比较[J].中国皮肤性病学杂志，2008，22（2）：118-119

[2]俞伟国，邬亚华，殷嫦嫦.梅毒螺旋体检测的适宜方法探讨[J].山东医药，2007，47（5）：47-48

[3]周君霞，巫翠云，何林.四种梅毒螺旋体检测方法的应用分析[J].山东医药，2008，48（1）：122-123