葛枣猕猴桃总酚含量与PPO活性研究

摘要：采用葛枣猕猴桃嫩枝和叶柄为供试材料，分析总酚含量和多酚氧化酶（ppo）活性及其变化规律。研究结果显示，葛枣猕猴桃PPO活性的最适pH值为7.0；最佳底物为邻苯二酚，且浓度为0.18mol·L-1；最佳温度为25℃。葛枣猕猴桃PPO活性在花果期明显高于花前期，葛枣猕猴桃总酚含量在每年的4月、5月、9月3个时段最低。

关键词：葛枣猕猴桃；多酚氧化酶活性；总酚含量

中图分类号：TS2文献标识码：Ａ

猕猴桃（Actinidia）是重要的经济植物，中国是其起源和分布中心，种质资源极为丰富［1］。同时，猕猴桃也是20世纪野生果树人工驯化栽培最有成就的4大果种之一［2］。由于其风味独特，各种营养丰富，维生素C含量高，经济、营养价值高和医疗效果显著而倍受关注。猕猴桃作为中华的一种传统植物，其全株均可入药，中医认为其果能调理中气、通淋、解热除烦、生津润燥，味酸、甘、性寒，在治疗食欲不振、消化不良、呕吐、烧烫伤上均有疗效，其根能活血消肿、祛风利、湿清热解毒，味苦、涩，性寒，在治疗风湿性关节炎、水肿、跌打损伤、痢疾等疗效不错［3］。葛枣猕猴桃（A.polygama）是猕猴桃中很有特色的一种小果型猕猴桃，具有很好的开发价值。分布于海拔1　000～2　800m的范围，落叶木质藤本果树。二年生枝深褐色，光滑无毛，细硬，皮孔密、小，圆形，灰白色。髓实心，白色。一年生枝细，硬，褐色，光滑无毛，皮孔较密，圆形，呈白色。节间长2.4～4.6cm。叶薄纸质，近圆形，长约7.1～10.7cm，宽4.6～8.9cm，基部平截、对称，先端渐尖，尾尖短，叶面绿色，无毛，主、侧脉不明显，无毛，叶缘锯齿小，刺状，浅红色，叶背绿色无毛。叶柄长2.5～3.3cm，呈绿色。果实近长扁椭圆形，单果重约9g，果皮绿色，被白粉，光滑无毛，果顶钝尖圆，具喙，较长，果肉黄色，，果熟期在当地9月中下旬至10月初。

葛枣猕猴桃是研究猕猴桃属系统遗传发育必不可少的一种珍贵材料。该种群分布范围相对较窄，且现存的野生植株数量不多，野生资源在野外很难发现，偶尔能发现几株或十数株。因此，葛枣猕猴桃需要着重加强保护。而进行人工无性繁殖是扩大其种群数量、加强保护的唯一途径。其中，总酚含量及多酚氧化酶（PPO）活性等指标与植物生长时期密切相关［4，5］，也是无性繁殖材料中影响成活的关键。通过葛枣猕猴桃总酚含量和多酚氧化酶活性及其变化规律的研究，可以更有效率地指导无性繁殖的取材，提高繁殖成活率，扩大种群数量，保护该种群。

１材料与方法

1.1材料

取葛枣猕猴桃叶柄和嫩枝条作为实验供试材料，测定正常葛枣猕猴桃植株在一年内各月的总酚含量与多酚氧化酶活性动态变化情况。

1.2葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性测定

1.2.1酶液制备

取葛枣猕猴桃嫩茎段总质量剪碎2.0g，加入少许石英砂以及PVP粉0.02g，再吸取10mL磷酸缓冲液（0.1mol·L－１pH7.0）加入并置于冰浴中混匀，然后以10　000rpm离心20分钟。取上层上清液转入到标准容积为25mL容量瓶，下层的沉淀再以磷酸缓冲液5mL重新提取1次，最后将沉淀中提取的上清液也并入容量瓶中，并定容容量瓶备用。

1.2.2酶活力计算与酶活性测定

酶活力是以每克新鲜样品、每分钟的光密度即相应的光吸收值的每增加0.01为1个酶活性单位U。从瓶中制备的酶液中取0.2mL加入试管中，再加入0.1mol·L－１pH7.0磷酸缓冲液3mL并缓慢摇匀，置于恒温水浴锅中，25℃水浴10min。然后加入0.5mL邻苯二酚（0.1mol·L－１），立即通过分光光度计测定470nm波长下的OD值，并用磷酸缓冲液（0.1mol·L－１，pH7.0）作为空白对照，记录读数，30秒/共记录5次。酶活力计算公式为：U=ΔOD/0.01×t×W其中，W为供试样品的鲜重。

1.2.3筛选最适测定条件

1.2.3.1葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性与pH值

分别设置缓冲液的不同pH值5.0，6.0，7.0，8.0，并用于提取葛枣猕猴桃多酚氧化酶，并利用邻苯二酚（0.1mol·L－１）测定其活性。酶活力作为纵坐标，提取缓冲液的pH值作为横坐标，观察并确定其最适pH值，利用测定值形成酶活力与pH曲线。

1.2.3.2不同底物及浓度对的影响

根据生物酶活性测定体系，通过实验设计并配制浓度梯度为0.02mol·L－１，0.06mol·L－１，0.12mol·L－１，0.18mol·L－１，0.20mol·L－１，0.24mol·L－１的邻苯二酚溶液以及阿魏酸溶液、肉桂酸溶液，测定葛枣猕猴桃多酚氧化酶在不同浓度及底物下的活性情况，观察并发现其最佳底物与浓度。

1.2.3.3葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性与不同温度的变化关系

将葛枣猕猴桃多酚氧化酶（PPO）置于不同温度梯度的酶活反应体系15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃，保持恒温环境，反应10min。然后测定PPO在不同温度体系中其活性的具体情况，观察并筛选出PPO相对的最适反应温度。

1.3葛枣猕猴桃总酚含量测定

1.3.1Folin酚试剂配制

取一个磨口回流装置且容积为1　000mL，加入钼酸钠12.5g，钨酸钠50g，蒸馏水350mL，37%的浓盐酸50mL，85%的浓磷酸25mL，充分溶解并在混匀器上完全混匀，然后回流10h。再加入87.3g　Li2SO4·H2O（水合硫酸锂），25mL蒸馏水，2滴溴水。取下磨口回流装置的瓶盖，15min持续沸腾，完全挥发加入的溴水，达到此目的为止，再静置冷却并得到呈现黄色的溶液。进行稀释该溶液至500mL并过滤，备一个保存用棕色试剂瓶将滤液移于其中保存。使用溶液时，以酚酞作指示剂，先用标准NaOH溶液滴定，观察溶液颜色变化，发现颜色由红过度到紫红，接着转变为紫灰，再突然很快换成墨绿时为终点，然后约加入1倍体积的水进行稀释，即可作为应用液使用。

1.3.2标准曲线的制作

取100mL70%的丙酮，用分析天平称取20mg，溶于其中。邻苯二酚对照品溶液的制备，在配制的0.2mol·L－１的邻苯二酚溶液中移取2mL，并加入蒸馏水稀释至4mL即可。分别移取0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL、0.30mL、0.35mL的邻苯二酚对照品溶液于准备好的7根带刻度的试管中，并用70%的丙酮补足至1mL；另外空白对照直接将1mL的70%的丙酮加入额外的1根试管中。此时，加上对照，共有8根试管。分别加入5mLFolin试剂于这8根试管中，缓慢混匀并静置3min，然后再加入2mL　20%的Na2CO3溶液，缓慢混匀并静置1h，最后用蒸馏水定容至25mL，利用分光光度计在760nm波长处测量吸光值。以光吸收值为纵坐标，邻苯二酚含量为横坐标，绘制标准的曲线。以邻苯二酚的含量表示样品中总酚物质的含量，线性回归方程为：Y=0.0816X+0.0094，R2=0.9994，邻苯二酚浓度在0.600～4.500μg·mL－１范围内与吸光值有良好的线性关系。

1.3.3葛枣猕猴桃样液的准备

取葛枣猕猴桃茎段的嫩枝，自然晾干并用粉碎机粉碎，用2mm的筛子过滤。然后称取5g粉末作为样品，移入带塞的锥形瓶中，并加入70%的丙酮100mL，置于水浴锅中恒温水浴80℃加热3h，冷却后再过滤，收集滤液并定容至100mL。

1.3.4葛枣猕猴桃样液的测定

准备一容积为25mL的容量瓶，取上一步中制备好的样液1mL移入其中，并用70%的丙酮定容。再向备用的带刻度的试管中加入1mL吸取于容量瓶中的样液，接着加入5mL　Folin试剂，缓慢混匀并静置3min。然后加入5mL的10%的Na2CO3溶液，混匀，避光静置1h，在加入蒸馏水定容至25mL；空白对照将1mL70%的丙酮加入另1根备用试管中即可，用分光光度计测定760nm波长下光吸光值的情况。

1.3.5结果与计算

1g样品中总酚含量（%）=（a×v1×v3）/（v2×w）×10-6×100，式中：v1为样品粉末定容后的容积（mL），v3为将v2滤液定容后的容积（mL），v2为测定时量取的滤液容积（mL），a为样液中总酚的含量（μg·mL－１），w为称样质量（g）。

2结果与分析

2.1多酚氧化酶活性与pH值之间的变化关系

不同的pH值下，葛枣猕猴桃多酚氧化酶的活性也不同（图1）。当pH值为7.0时，酶活力单位最大；当pH值为5.0时，多酚氧化酶活性最小，随着pH值的增大，活性也增加；但当pH值为8.0时，酶活力又降低。在设计的pH值梯度中，实验结果表明，当磷酸缓冲液pH值为7.0时葛枣猕猴桃的多酚氧化酶活性最大。因此，可将pH值7.0作为葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性的最适pH值。

图1pH值对葛枣猕猴桃PPO活性的影响

2.2葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性与不同底物及浓度的关系

筛选实验设计的阿魏酸、邻苯二酚和肉桂酸作底物比较实验显示，以邻苯二酚作为底物，葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性最高。然后以邻苯二酚作实验最适底物，并设计邻苯二酚浓度梯度进行进一步实验分析。结果显示，实验中筛选得到的0.18mol·L－１的邻苯二酚为最佳底物。而整个结果分析表明，首先随着邻苯二酚浓度升高，葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性也增加，但当浓度超过0.18mol·L－１时，多酚氧化酶活性又开始降低（图2）。

图2不同底物及浓度对葛枣猕猴桃PPO活性的影响

2.3葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性与反应体系温度的关系

依据酶活性反应温度范围，设置了15～75℃温度区间的反应体系温度实验测试。实验表明，温度在25℃时葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性最大，温度超过25℃时多酚氧化酶活性开始逐渐降低，当温度达到75℃时，多酚氧化酶基本丧失活性（图3）。因此，25℃是葛枣猕猴桃多酚氧化酶在实验中的最适温度。

图3温度对葛枣猕猴桃PPO活性的影响

2.4葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性和总酚含量的动态变化

2.4.1多酚氧化酶活性月动态变化

取各个月份的葛枣猕猴桃新鲜材料进行多酚氧化酶活性测定，从而分析其活性随时间的变化情况。分析结果显示，酶活性较高的是9月、8月、7月和4月，其中9月多酚氧化酶活性最高；12月酶活性最低，其次为10月、2月和1月。6～9月，2～4月酶活性逐渐升高，可能原因是植物处于生长季节，体内的多酚氧化酶表现的较为活跃，活性显著高于休眠季节；12月、1月和2月是冬季时节，酶活性较低，植物生长缓慢，变化不明显。

图5葛枣猕猴桃PPO　活性月动态变化

2.4.2葛枣猕猴桃总酚含量月动态变化

通过Folin酚试剂法，取各个月份的葛枣猕猴桃试材进行总酚含量测定，分析其总酚随时间的变化情况。不同月份葛枣猕猴桃茎段1g干样品总酚含量的变化曲线是根据标准曲线及总酚含量计算公式计算形成的，见图5。分析显示，总酚含量最低的是4月，其次为3月和9月；含量最高的月份为6月，其次为1月、7月、8月和11月。4月和9月分别为春初生长和秋末减缓的季节，而已步入休眠期的11月、12月和1月及生长旺盛的6～8月总酚含量较高，说明葛枣猕猴桃生长中的物候期与总酚含量有较为密切的关系。

图5葛枣猕猴桃总酚含量月动态变化

3结论与讨论

磷酸缓冲液pH值对葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性具有明显影响，当pH值为7时，多酚氧化酶活性最高；而在酸性条件下，随pH值升高，多酚氧化酶活性显著增强，当pH值超过7为碱性，随pH值增大，多酚氧化酶活性开始下降，最后认为在测定葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性的最适pH值为7.0。其次，邻苯二酚是对葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性最好的反应底物，但其浓度对活性有显著影响，其中邻苯二酚浓度在0.18mol·L－１时多酚氧化酶活性能得到最佳体现。再次，在测试的15～75℃温度梯度范围内，尤其以反应体系温度为25℃时，葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性最高，在高于25℃的温度梯度上，其多酚氧化酶活性逐渐降低，当反应体系温度为75℃时，其活性基本失活；因此，在实验范围内，葛枣猕猴桃多酚氧化酶的最适温度是25℃。最后，葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性，在生长期明显高于休眠期。葛枣猕猴桃枝条体内总酚含量在每年的9月、5月、4月3个时段最低，为无性繁殖取材最佳时间。

总之，葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性及性质与其他植物较为接近，属于正常情况，但酶活性在时间上变化较为滞后，从而导致葛枣猕猴桃在开花及果实发育与成熟等阶段相对于其他商品猕猴桃品种较为延后。因此，本研究对以后葛枣猕猴桃的研究及培育有重要的指导意义。

参考文献

［1］Desmong　O　R．World　kiwifruit　review　2008　edition．I．Production　of　fresh　kiwifruit　［Z］．Pullman，Washington：Belrose，Inc．，2008．

［2］中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志49（2）［M］．北京：科学出版社，1984：261．

［3］全国中草药汇编编写组．全国中草药汇编（上册）［M］．北京：科学出版社，1975：795．

［4］宋立江，狄莹，石碧．植物多酚研究与利用的意义及发展趋势［J］．化学进展，2000，12（０2）：161－１70．

［5］胡青霞．石榴果皮中多酚氧化酶测定最佳试验条件的确定［J］．河南农业科学，2007（０2）：81-83．