人宫颈癌组织中survivin的表达与临床分析

【摘要】 目的：检测人宫颈正常组织、宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN）以及宫颈癌组织中survivin蛋白的表达定位，研究该因子与宫颈癌发生发展的关系和临床应用价值。方法：收集2年间某医院97例患者的石蜡组织标本，其中正常宫颈组织20例、CIN25例、宫颈癌52例。采用免疫组化方法检测组织切片中的survivin蛋白，研究该因子在组织中的蛋白表达定位。结果：在宫颈组织中，survivin蛋白在胞核以及胞浆内均可见阳性染色，主要定位于细胞核。正常组survivin阳性率为5.0%，CIN组阳性率为56.0%，宫颈癌组阳性率为82.7%。survivin在宫颈癌组织中的高表达，与宫颈癌的临床分期、病理分化以及淋巴结转移均呈正相关。结论：survivin与宫颈癌的发生发展密切相关，可能成为对人宫颈癌的预防、诊治，以及判断预后有价值的临床肿瘤相关指标。

【关键词】 宫颈癌； Survivin； 表达

妇科最常见的恶性肿瘤是宫颈癌，发患者群逐渐年轻化，发病率也呈升高趋势。宫颈良性病变经过逐步发展，过渡到上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia， CIN），再从宫颈原位癌进展到浸润癌。宫颈癌的早期诊断、发生发展及预后相关因素是目前妇科肿瘤的研究热点。survivin作为一种重要的细胞周期依赖性凋亡抑制因子，在人类的多种肿瘤显示了广泛表达，survivin的研究在肿瘤的诊断和治疗上具有潜在的价值。目前，survivin与国人宫颈癌的基础与临床研究尚不多见。本研究区分正常宫颈、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌3个组，通过免疫组化法检测survivin在人宫颈组织中的表达定位，分析survivin与宫颈癌的发病、临床分期、组织分型、淋巴结转移等因素，研究survivin与宫颈癌的发生发展、诊断治疗、以及预后的关系，评估survivin在宫颈癌的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例资料来源于山东省淄博市中心医院，统计区间为2008年1月-2009年12月共2年时间。共收集2年间的患者石蜡组织标本97例，其中经病理确诊的CIN患者25例、宫颈癌患者52例，对照组为20例正常宫颈组织。患者年龄34～71岁，平均47岁。术前，患者均未接受化疗、放疗以及内分泌等治疗。按国际妇产科联盟（international federation of gynecology and obstetrics，FIGO）的临床分期标准，宫颈癌患者Ia期7例，Ib期18例，Ⅱa期13例，Ⅱb期10例，III期4例。手术38例，临床分期为Ia期～Ⅱa期；Ⅱb期以上14例，行放化疗或综合治疗。其中，鳞状细胞癌37例，腺癌11例，腺鳞癌4例。癌组织分化情况：高分化11例，中分化21例，低分化20例。手术治疗的38例，有淋巴结转移者9例，无转移者29例。

1.2 主要试剂及仪器 主要试剂：兔抗人survivin单克隆抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司；通用SP试剂盒购自北京中山公司；DaKoDAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。主要仪器设备有Motic Med 6.0数码医学图像分析系统、XLCU- PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪、DaKo免疫组织化学染色机、Leica RM2235型石蜡切片机、日本奥林巴斯BX51型光学显微镜等。

1.3 实验方法 将石蜡包埋宫颈组织标本制作4 μm厚的病理切片，采用S-P法进行免疫组化染色，按照试剂盒说明书进行组织染色，常规设阴性对照。主要实验步骤如下：石蜡切片脱蜡至水，将脱完蜡的切片装载放入修复仪中，修复18 min，缓冲液冲洗5 min，在切片滴3%的H2O2溶液，室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，每次3 min；滴加一抗，兔抗人survivin单克隆抗体，稀释度1：100，存于湿盒中，4 ℃冰箱过夜；次日清晨取出湿盒，恢复至室温，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加二抗，湿盒37 ℃孵育40 min，PBS冲洗3次，每次5 min；DAB显色3～6 min，放自来水中终止显色，水洗；苏木素轻度复染5～10 min，水洗；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 评判标准 参考尹如铁等[1]的标准判断survivin在宫颈组织的免疫组织化学表达分布，阳性染色位于胞浆或胞核，出现棕黄色染色颗粒者为阳性细胞，染色强度分级如下：无染色计0分；轻度染色为淡黄色，计1分；黄色为中度染色，计2分；棕黄色为重度染色，计3分，根据阳性细胞占全部肿瘤细胞的百分比进行统计。每张切片由2位病理医师采用盲法观察计数，每张切片观察5个高倍视野，每视野选200个细胞，计算切片阳性表达量。0分，阳性细胞≤5%；1分：5%～25%；2分：26%～75%；3分：>75%。切片阳性染色细胞数量和染色强度评分的乘积≥1为阳性，

1.5 统计学处理 采用数码医学图像分析系统进行切片的图像采集和分析测定，应用SPSS 13.0软件，对survivin蛋白分别在相应各组阳性表达率的比较采用 字2检验，以P

2 结果

2.1 survivin蛋白的表达情况 结果显示，survivin蛋白在细胞核及细胞浆内均可见阳性表达，主要表达定位于细胞核，阳性染色呈棕黄色颗粒状分布。图1～2分别为survivin蛋白在正常宫颈和CIN组织的表达情况；图3～5为survivin蛋白在宫颈鳞癌和腺癌中的表达情况。survivin蛋白在细胞的阳性染色，在正常宫颈组织仅有少数细胞染色阳性，呈浅棕黄色，在CIN、宫颈癌组织中，颜色逐渐加深，直至棕黄色，强度由弱到强，阳性细胞由少到多。

survivin蛋白在正常宫颈组织中阳性表达率为5.0%，在CIN病例的组织切片中阳性表达率为56.0%，在子宫颈癌病例的组织切片中阳性表达率为82.7%。宫颈上皮内瘤变组织及宫颈癌组织的survivin蛋白阳性表达显著增高，与宫颈正常组织比较差异有统计学意义（P

2.2 临床及病理因素分析 在52例宫颈癌患者的不同年龄组，≤50岁及>50岁，survivin阳性表达率分别为82.5%和83.3%。不同病理类型中，鳞状细胞癌阳性表达率为78.4%，腺癌为90.9%，腺鳞癌为100%。不同年龄间与不同病理类型间survivin蛋白的表达均差异无统计学意义（P>0.05），在临床Ⅰa～Ⅱa期和≥Ⅱb期， survivin的阳性率分别为76.3%（29/38）和100%（14/14），差异有统计学意义（P

3 讨论

作为妇科最常见的恶性肿瘤，宫颈癌的基础与临床研究是目前妇科肿瘤领域的重要领域。针对宫颈癌的基础研究和早期诊断、发生发展，以及治疗和预后等相关临床因素的研究，是妇科肿瘤研究的热点[2]。survivin作为一种重要的细胞周期依赖性凋亡抑制因子，在人类的许多肿瘤有广泛表达，在肿瘤的诊断和治疗上具有潜在的重要价值。

survivin是凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的新成员，是联系细胞周期和细胞凋亡的重要因子，具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的功能。survivin与恶性肿瘤的发生﹑发展及预后关系密切。survivin是迄今为止发现的最小的IAP家族成员，survivin基因位于染色体17q25，基因全长14 700 bp，编码产生由142个氨基酸组成的蛋白，相对分子质量为16.5×103，相对分子质量在IAP家族中最小，富含疏水基团，能与纺锤体上的微管蛋白结合，从而抑制细胞凋亡[3]。survivin具有抑制凋亡作用的氨基酸残基，与caspase-3和caspase-7抑制caspase的活性，可阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡。survivin在细胞G1期表达极低，在S期上调6.2倍，G2/M期则上调40倍，显示其高表达具有细胞周期特异性，是G2/M期的调控基因[4]。survivin在细胞的G2/M期能对抗异常因素诱导的细胞凋亡，而肿瘤细胞survivin的异常表达，能使细胞克服这个凋亡调控点而利于转化细胞完成异常的有丝分裂。研究发现，survivin存在于线粒体、细胞核、细胞质等亚细胞结构，以及细胞外间隙，survivin是通过外核体，采用细胞外分泌途径释放到细胞外的[5]。survivin主要分布于胚胎及分化未成熟的组织，除了在胸腺及胎盘中有微量表达外，在成人体内所有分化成熟的组织均无表达，而在几乎所有人类肿瘤中高表达，且表达具有肿瘤细胞依赖性，另外，在癌前病变的组织中也发现了survivin基因的存在。survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，survivin的高表达能抑制p53、caspase等诱导的细胞凋亡，有利于肿瘤的进展。除了抑制细胞的凋亡，survivin还参与细胞增殖、分裂的调控。在有丝分裂初期，survivin与有丝分裂纺锤体微管结合，降低了凋亡的发生，维护了有丝分裂的正常进行。针对survivin的基因沉默技术，可以产生抗肿瘤作用[6]。

survivin广泛表达于人类各种肿瘤中，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、晚期淋巴瘤、神经纤维瘤、胃癌、肺癌、胆囊癌等，除了胸腺和胎盘少量表达外，成人正常组织中均无表达[7]。相关基础与临床的研究均显示，survivin与妇科肿瘤关系密切。Erkanli等[8]研究发现，survivin在子宫内膜腺癌中的表达明显高于增生期的子宫内膜。Liguang等[9]发现，survivin的阳性表达率与卵巢肿瘤的组织学分级、临床分期密切相关，在组织学类型之间也存在明显差异。在survivin表达阳性的组织中，survivin mRNA的表达水平由低至高依次为良性肿瘤、卵巢交界性肿瘤和卵巢恶性肿瘤。survivin蛋白的表达与卵巢癌的临床分期、组织分类明显相关。Branca等[10]研究发现，宫颈癌的临床级别与survivin表达有显著的线性关系，survivin可作为宫颈癌变发生的一个早期标志物。survivin的过度表达与高危型人状瘤病毒的类型有关。Bache等[11]指出，晚期宫颈癌放疗患者中survivin的表达水平与患者5年生存率相关。Lee等[12]研究发现，在未接受过治疗、肿瘤直径>4 cm、有淋巴管浸润及鳞状上皮细胞癌抗原水平升高的患者中survivin表达增加，提示其可作为宫颈癌的一个预后指标。

本实验结果显示，survivin的阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于细胞核，少数定位于细胞浆，或在胞浆和胞核同时表达。图1～5分别显示的是survivin在正常宫颈组织中的阴性表达，以及在CIN和宫颈癌组织中的阳性表达。由图可见，正常宫颈组织细胞核蓝染，未见棕黄色颗粒，而在CIN和宫颈癌组织中，细胞核着色由浅棕至棕黄色，染色强度表现为由弱阳性到强阳性的变化规律，且阳性细胞的数量由少到多。数据显示，正常宫颈组织中survivin表达率为5.0%，CIN组织中表达率为56.0%，在宫颈癌中表达率为82.7%。与宫颈正常组织比较，CIN、宫颈癌survivin蛋白阳性表达显著增高；与CIN组进行比较，宫颈癌组survivin蛋白的表达也增高，从CIN到子宫颈癌组织，survivin蛋白的表达逐步增强。

宫颈癌的发生发展是一个渐进过程，据测算，从宫颈癌的癌前病变发展到宫颈癌，大约需要10年时间。由于宫颈癌有较长的癌前病变阶段，故预防和治愈宫颈癌的关键是要进行筛查，尤其对存在高危因素患者，定期筛查有助于及早发现癌前病变，积极治疗癌前病变可阻断病变的进一步进展，使宫颈癌得到早期诊断并及早恰当治疗。本实验结果显示，对survivin的检测可能对宫颈良恶性病变的鉴别具有重要价值，并可能对子宫颈癌的发生及早期诊断提供依据。在不同年龄组，≤50岁及>50岁survivin阳性表达率分别为82.5%和83.3%，差异无统计学意义（P>0.05），说明survivin在宫颈癌中的异常表达与年龄无关。

本实验结果还显示：survivin在临床Ⅰa～Ⅱa期和≥Ⅱb期的阳性表达率分别为76.3%和100%，有显著差异，显示survivin的阳性表达率与宫颈癌临床分期有关。影响宫颈癌预后的因素很多，其中比较重要的是临床分期、肿瘤分级以及淋巴结转移的情况，临床期别越早，治疗效果越好。宫颈癌的早期诊断及治疗对预后至关重要。本资料显示，随临床分期的增高，survivin的阳性率升高。提示survivin在宫颈癌的阳性表达与分期有关，可能与宫颈癌的发展及预后相关。在分子生物水平为宫颈癌的发展及预后的评估提供重要依据。

在不同的组织分化中，survivin在高分化、中分化及低分化癌组织中的阳性表达率分别为45.5%、85.7%和100%，有显著差异，随着分化程度的降低，survivin的阳性表达率上升，提示survivin在宫颈癌组织的异常表达可能与组织分化不良及预后相关，其高表达可作为判断组织恶性程度的参考指标。组织形态和病理分级同样对宫颈癌的预后起着非常重要的作用。对临床分期及治疗方法相同的患者，其治疗效果和预后也会因组织病理形态不同或病理类型相同而分化程度不同而不同。尤其是腺癌，易较早出现转移。本资料中，图3～5为survivin在鳞状细胞癌和腺癌中的表达，survivin在鳞癌中阳性率为78.4%，腺癌中表达率为90.9%，腺鳞癌中表达率为100%。不同病理类型间survivin的表达差异无统计学意义，说明survivin在宫颈癌中的异常表达与病理类型无关。但统计结果显示survivin在不同分化癌组织中的阳性率比较差异有统计学意义（P

在Ⅰa～Ⅱa期的38例手术患者中，survivin在宫颈癌组织中有淋巴结转移的阳性表达率为100%，无淋巴结转移的阳性表达率是65.5%，两者差异显著。这也充分提示了survivin的表达与宫颈癌的发展、预后可能相关。这与卢洪胜等[13]的研究结果基本一致。与其他部位的癌瘤一样，宫颈癌在发展过程中不断生长、蔓延并发生转移，宫颈癌患者有无盆腔内或远处的淋巴结转移，是影响子宫颈癌的治疗效果及预后的重要因素之一。survivin在有淋巴结转移的宫颈癌组织中高表达，同样在评估肿瘤的恶性程度及预后方面发挥重要作用。

目前关于survivin与国人成年女性CIN以及宫颈癌关系的文献报道较少。前述统计数据表明，与正常子宫颈组织比较，在CIN以及宫颈癌组织中，survivin的表达率明显增高。survivin在宫颈癌组织中的表达水平，与宫颈癌的临床分期、周围淋巴结转移、以及病理组织分化有一定的相关性，说明survivin与人宫颈癌的发生、发展及预后密切相关的一项重要指标，survivin可能成为对成年女性子宫颈癌的早期诊断，以及判断预后非常有价值的肿瘤标志物。本实验未对患者5年生存率进行统计，今后可进一步对患者进行随访，综合评估预后，继续进行深入研究，以明确survivin与宫颈癌预后的关系。

survivin有抑制细胞凋亡，参与细胞增殖调控的作用，与细胞增殖关系密切。宫颈病变从良性病变发展为CIN、原位癌、浸润癌，整个过程是连续的，故对病变的早期诊断、治疗将对患者疾病的发展、预后转归至关重要。survivin的研究在宫颈癌的诊断和治疗上具有潜在的价值，测定其表达可早期发现癌前病变，可能为今后宫颈癌的早期诊断、预测发生、发展及评估预后开辟新的应用前景。

致谢：衷心感谢潍坊医学院基础医学院梁淑娟教授、潍坊市人民医院妇科陈芳副主任、淄博市中心医院肿瘤科孙银萍副主任给予本研究的悉心指导。

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（收稿日期：2013-09-22） （本文编辑：黄新珍）