野生关黄柏中生物碱及绿原酸含量区域性特征分析

[摘要]该研究在关黄柏基源植物黄檗的整个分布区内，以每一个纬度为间隔设置采样点，在控制采样植株茎粗、采样部位及采样时间的前提下，于31个样点共采集674份野生关黄柏药材样本。对样本中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、木兰花碱和绿原酸等6种活性成分的含量进行测定发现，药材中6种活性成分的含量因采样点的不同存在显著差异，辽宁地区所产药材6种活性成分含量最高，其次为北京和吉林地区，黑龙江地区药材的含量最低，研究结果对探究关黄柏药材活性成分形成的环境因素及人工种植区划具有重要的指导意义。

[关键词]关黄柏；黄檗；活性成分；区域性特征；差异性分析；聚类分析

[Abstract]In the present research， 674 wild medicinal material samples of Phellodendri amurensis Cortex were collected from 31 sampling sites in the whole distribution of its original plant Phellodendron amurense The samples were collected under the premise that the stem diameter of sampling plant， sampling position and time were controlled And the sampling sites were set at the interval of a latitude The content of 6 kinds of active ingredients， palmatine chloride， berberine hydrochloride， phellodendrine chloride， jatrorrhizine hydrochloride， magnoflorine， chlorogenic acid， etc in the medicinal material samples were determined， and the results showed that the content of most active ingredients in the medicinal materials showed significant differences due to the difference of sampling sites Among them， the medicinal materials from Liaoning region had the highest content of active ingredients， followed by Beijing and Jilin regions， and that from Heilongjiang region had the lowest content The study has important directive significance to the exploration of environmental factors for the formation of active constituent and artificial planting regionalization of high quality Phellodendri amurensis Cortex

[Key words]Phellodendri Amurensis Cortex； Phellodendron amurense； active constituent； regional characteristic； difference analysis； clustering analysis

doi：10.4268/cjcmm20161006

黄檗的干燥树皮，除去粗皮晒干后为我国传统常用中药关黄柏[1]，关黄柏常用于清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮；生物碱作为黄檗主要的次生代谢产物，被认为是药材关黄柏的重要活性成分，具有抗炎，抗肿瘤，抗过敏和降血糖等药理活性[24]。作为常用药材，关黄柏是多种中成药的原料药，市场需求很大。由于生存环境恶化，对关黄柏的需求增加以及黄檗自我更新障碍影响资源恢复等原因的长期存在，黄檗野生资源急剧减少，分布范围越来越小。黄檗已被列为重点保护野生药材和国家Ⅱ级保护物种[56]，野生资源受国家法律保护，目前国内市场对关黄柏药材的需求主要依靠进口[79]，关黄柏药材的长期供应只能通过人工种植加以解决，确定形成优质药材的生态适宜区域，是保障优质关黄柏药材生产的重要研究内容。2013年以来，作者对整个黄檗分布区所产野生关黄柏药材中5种生物碱类成分及绿原酸的含量进行了比较研究，用于评价各地所产药材的特性，以期为关黄柏药材的人工种植及规范化生产提供客观、准确的优质药材生产依据。

在自然环境的作用下，植物中次生代谢产物的合成与积累会发生复杂变化[10]，只有在实验样本的代表性和可比性得到充分保障的前提下，生态条件与次生代谢产物之间相关性研究的结果才有可能客观、真实。在本研究中，对采样策略进行了严格控制，以保证样本的可比性和研究结果的科学性。《中国药典》2015年版中以盐酸巴马汀和盐酸小檗碱作为关黄柏药材质量检测的指标性成分，但黄檗分布广泛，成分复杂，单独2个成分不足以对其次生代谢产物进行全面评价，为此，建立了同时测定关黄柏药材中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、木兰花碱、和绿原酸等6种化学成分含量的检测方法[11]，并在此基础上对黄檗的区域性化学特征进行研究。

1材料与方法

11采样点布局

文献记载，黄檗分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、北京、内蒙古、山西、河南、宁夏等省（区、市）[1215]。然而由于过度利用及自我更新障碍等原因，使得黄檗野生资源面积逐渐缩小，目前东北三省和北京地区是黄檗的主要分布区，而黑龙江省的资源存有量最大。黄檗为阳性植物，苗期耐阴能力较强，成年属喜光树种，喜湿润，在土壤腐殖质深厚、排水较好的环境中生长良好，在沼泽、干旱贫瘠的土地上生长不良，分布稀少[1516]。此外，由于人为干扰、开垦农田等原因致使人类活动密集的地区黄檗野生资源分布极其稀少。目前，野生黄檗仅分布在燕山山脉东北部、千山、长白山、张广才岭、完达山、小兴安岭以及大兴安岭东南部林区，极少有较大面积的人工种植。

根据以上特点，确定实验样本采集范围为：燕山山脉东北部、千山南麓为最南端，向北经长白山、张广才岭，至最北端小兴安岭北部，以1个纬度为间隔沿山脉自南向北，每1个纬度设置1～4个采样点，横跨东北地区主山脉东西两个坡向，南北跨越9个纬度，从 3980°N（庄河市长岭镇）至 4878°N（乌伊岭区双河林场），经度从 11543°E（小龙门自然保护区）至 13050°E（勃利县通天二林场），样点基本覆盖黄檗的主要分布区。

12药材样本采集

121采集部位《中国药典》中关黄柏药材来自芸香科植物黄檗的干燥树皮。研究发现，黄檗成年植株不同器官、部位中生物碱的含量存在差异，小檗碱和药根碱在根韧皮部中含量最高，而巴马汀则在树干和侧枝的韧皮部中含量最高；同时还发现，黄檗树干韧皮部中主要药用成分含量的方位差异不显著，但随着树干高度的增加，主要药用成分的含量逐渐降低[17]。本实验统一在黄檗树干胸径处（离地面13 m）取5 cm×5 cm的树皮，除去粗皮，取其韧皮部作为样本。

122采集季节药材的采收期具有很强的时间性，不合理的采收会影响药材的品质、疗效以及有效成分的含量等。通常，皮类药材的采收在植株的生长期，即5―9月，此时植物体内水分、养分输送旺盛，形成层细胞分裂较快，韧皮部与木质部容易分离，而且由于生长期分裂旺盛，较易恢复[18]。此外，研究发现黄檗中主要药用成分含量在不同季节中存在差异，不同的成分在季节变化中不尽相同，但均是夏、秋季高于春季[19]。因此，本实验的样本统一集中在7月中旬至9月中旬近2个月的时间内采集，以保证药材采收期的一致性。

123采集植株黄檗中主要药用成分的含量在一定时间范围内随着树龄的增加而增多，对野生树木的年龄进行无创伤界定比较困难，而树龄与胸径存在极显著正相关[2021]关系，在有关野生林木的研究中常用胸径替代树龄进行相关比较研究。有研究报道，树龄8年以上的黄檗树皮中，盐酸小檗碱含量达到药用要求并开始趋于稳定，在树龄10年时盐酸小檗碱含量达到最大值，后随着树龄的增加有微弱下降的趋势，但并不显著[22]。种植于中国医学科学院药用植物研究所植物园内16年树龄的黄檗，胸径为10 cm左右，经测定韧皮部中巴马汀和小檗碱的含量均达到药典规定标准。基于以上信息，本实验采集样本的个体均要求：胸径大于10 cm，各样点的个体须为处于相同林分条件下生长良好的成株，以最大程度减少个体差异和树龄因素对含量测定结果的影响，实验样本株茎级结构见图1。

124药材样本信息共采集了31个样点的野生关黄柏药材样本674份，各批次样本经中国医学科学院药用植物研究所张昭研究员鉴定为黄檗Phellodendron amurense的干燥树皮，保存于中国医学科学院药用植物研究所资源中心。样品采集信息见表1。

13活性成分的提取及含量测定

采用超声提取法提取关黄柏药材中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、木兰花碱和绿原酸等6种活性成分，并按照张阳等[11]的方法测定各成分的含量。

2结果与分析

21各样点药材活性成分含量分析

分别测定31个样点药材样本中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、木兰花碱和绿原酸的含量，测定结果见表2。

《中国药典》2015年版中规定关黄柏药材中含盐酸小檗碱（C20H17NO4・HCl）不得少于060%，盐酸巴马汀（C21H21NO4・HCl）不得少于030%。通过含量测定结果可以看出，不同样点药材样本的含量差异较大。从盐酸小檗碱的含量来看，31个样点的药材中有4个样点的平均含量低于《中国药典》中规定的060%，分别是S18，S23，S25，S28号样点，均分布在黑龙江省；从盐酸巴马汀的含量来看，31个样点的药材平均含量均高于《中国药典》中规定的030%。结果表明，本研究的样点中有近13%的样点所产药材的指标性成分含量达不到《中国药典》的要求。

31个样点的药材中6种活性成分的平均含量差异较大，各样点样本中盐酸小檗碱的平均质量分数在499～2101 mg・g-1，盐酸巴马汀的平均质量分数在307～1042 mg・g-1，盐酸黄柏碱的平均质量分数在125～494 mg・g-1，绿原酸的平均质量分数在096～358 mg・g-1，含量差异均达3倍以上；盐酸药根碱的平均质量分数在019～044 mg・g-1，木兰花碱的平均质量分数在681～1453 mg・g-1；盐酸黄柏碱和绿原酸的平均含量在各样点中均相差2倍以上。

22药材活性成分聚类分析

以31个样点的关黄柏药材中6种活性成分的平均含量为分析对象，运用SPSS软件对其进行聚类分析，选用平方欧氏距离（Euclidean）计算样本间相似性测度，用离差平方和法（Ward′s Method）进行系统聚类分析，得到不同地域关黄柏药材中盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、木兰花碱和绿原酸等6种活性成分的树状聚类图谱，见图2。

由图2可见，最短距离法将31个样点的关黄柏药材聚为2类，其中第Ⅰ类包括S13，S16～S20，S22～S29，该类样品中的6种次生代谢产物的含量均较低，包括盐酸小檗碱的平均含量未达到《中国药典》规定的不低于060 %的4个样点，即S18，S23，S25，S28号样点，其中S13号样点位于吉林桦甸市红石镇，S29号样点位于北京市海淀区鹫峰森林公园，该地的黄檗为人工播种林（无人工管理），植株间距约15 m，由于过密植株生长状况不良，剩余其他样品均来自黑龙江省。第Ⅱ类则包括S1～S12，S14～S15，S21，S30，S31，该类中的样品来自北京、辽宁和吉林，各样点样品中6种次生代谢产物的平均含量较高，明显高于第一类，包括6种次生代谢产物平均含量均很高的S4号样点的样品，采自辽宁凤城市凤凰山景区。

聚类分析图清楚地描绘了各样点关黄柏药材中6种活性成分含量的相对关系，含量较低的样点（第Ⅰ类）绝大部分位于黑龙江地区，主要包括张广才岭和小兴安岭2个山脉的样点，该地区的黄檗中6种活性成分在整个分布区内含量最低。含量较高的样点（第Ⅱ类）主要为辽宁、吉林和北京地区的样点，包括燕山、千山和长白山3个山脉的样点，该地区黄檗中6种活性成分在整个分布区内含量最高。

23各产区药材活性成分差异性分析

将各样点按省市进行分组，考察黑龙江省、吉林省、辽宁省以及北京市四地关黄柏药材中6种活性成分含量情况，见图3。辽宁省产区药材中绿原酸平均含量最高，明显高于黑龙江省和北京市，与吉林省相差不大；木兰花碱平均含量最高，显著高于黑龙江省和北京市，与吉林省持平；盐酸巴马汀平均含量最高，明显高于黑龙江省和北京市，与吉林省基本一致；盐酸小檗碱平均含量最高，显著高于吉林省和黑龙江省，与北京市药材含量相差较小。黑龙江省药材中盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱的平均含量最低，明显低于其他3个省市。盐酸药根碱平均含量在药材中最低，在各省市之间变化很小，无明显差异，见表3。

4个产区关黄柏药材中盐酸巴马汀的平均含量均高于国家药典标准；黑龙江产区盐酸小檗碱的含量普遍较低，部分样本的含量达不到国家药典标准；辽宁产区的药材中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的含量均明显高于国家药典标准，且处于黄檗整个分布区内的最高水平；吉林和北京产区的药材则处于中间水平。数据显示，黑龙江产区关黄柏药材中药典规定的2种指标性成分的含量均低于其他省市，而辽宁产区关黄柏药材中6活性成分的含量均最高。

3讨论

通过本研究结果发现，辽宁地区关黄柏药材中6种活性成分含量明显高于黑龙江地区，从生态条件来看，黄檗适宜生长在阳光充足、湿热的环境中，而黑龙江地区降水量、日照时数和年均温等均低于辽宁地区，生长在黑龙江地区的黄檗其生长期也明显短于辽宁地区。关黄柏药材主产区为东北三省及华北北部，尤以黑龙江地区资源最为丰富，因而被认为是主要道地产区。仅从本研究结果来看，黑龙江地区关黄柏药材中药典规定的指标性成分含量较低，部分样本甚至低于药典要求，结果提示应对关黄柏药材基于中药疗效的活性成分进行研究，探讨仅以生物碱类成分作为关黄柏的质量控制指标是否恰当。在现有质量管理框架下，对关黄柏药材种植进行规划时，可重点考虑辽宁产区。

不同地域黄檗中活性成分含量具有显著差异，其主要原因是各地气候、土壤等生态因素的不同，从北京所在的燕山，到辽宁、吉林所在的千山、长白山，最后到黑龙江所在的张广才岭和小兴安岭，南北相差9个纬度，各样点的温度变化幅度及降水量变化很大，土壤环境中各元素的含量也可能相差迥异，不同的气候条件和土壤环境很容易导致黄檗中各成分的含量差别较大，希望本研究结果能为深入探讨生态因子对药材质量的影响、黄檗资源的保护与利用提供科学依据。

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