老鼠骨髓膜片的组建特性

本文作者：安玉林 那思家 韦蔚 陈哲 王国轩 杜建宇 金岩 单位：第四军医大学口腔医学院组织工程中心

近年来，利用组织工程相关产品作为体表创面、溃疡面修复体的研究和产品开发成为该学科的热点。现已上市的产品利用可降解的材料作为细胞的临时支架并接种皮肤相关细胞达到修复全层或单层皮肤缺损的目的［1］。但是，体外培养、消化细胞接种的方法难以达到理想的修复效果［2－3］。目前，一种不含支架材料的细胞膜片被发明［4］。细胞膜片通过在体外诱导2～3周使细胞分泌大量细胞外基质(ECM)而形成，并可用温敏材料或机械力刮下而获得［5］。它保存了细胞间的连接和细胞外基质的自然形态，能使细胞最大限度的发挥自身特性。目前细胞膜片已被应用于如角膜、心肌缺损和骨折的修复等各领域研究中［6－8］。而在皮肤创伤修复领域中却未见报道。骨髓间充质干细胞以其良好的自我更新和多向分化能力［9］，以及分泌大量ECM的性质成为组织工程和构建细胞膜片的理想种子细胞［10］。已有不少研究指出，骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell，BMMSCs)发挥其促进再生和愈合的作用依赖于其分泌的大量细胞因子和趋化因子［11］。本研究旨在稳定构建大鼠BMMSCs细胞膜片的基础上，对其基本生物学特性进行鉴定。并通过探索其分泌的促进皮肤组织再生的细胞因子，探讨BMMSCs细胞膜片应用于皮肤创伤愈合的可行性。

1材料和方法

1．1材料SD-GFP荧光大鼠，2周龄，180～200g［SD-Tg(GFP)2BalRrrc，RatResourceAndResearchCenter，美国］;α-MEM培养基、胰酶(2．5g/L)、谷氨酰胺、青链霉素(Gibco，美国);胎牛血清(四季青公司);维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3－异丁基－1－甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素;氯仿、异丙醇、75%乙醇;FITC标记抗大鼠CD90、CD105、Sca-1抗体(Ab-cam);引物序列(上海生工)(表1);反转录试剂盒(DRR037A，TaKaRa)、Epoch酶标仪(Biotech)、CO2细胞培养箱(Thermo)、倒置显微镜、7500型RT-PCR仪(AppliedBiosystems)。

1．2方法与步骤

1．2．1大鼠原代BMMSCs的分离培养选用2周龄的SD-GFP大鼠，雌雄不限。脱颈处死并取其长骨骨髓，离心后用10ml含10%FBS的α-MEM培养液重悬，接种于大培养瓶内，成为原代培养细胞。每48h换液，待细胞生长汇合超过70%时，用胰酶/EDTA(0．25/0．1，pH=6．4)传代。

1．2．2BMMSCs鉴定细胞表面标记物检测:选取培养的第3代BMMSCs消化并用PBS重悬，调整细胞密度为1×106/ml。加入标记有荧光素的一抗后4℃孵育1h，PBS洗涤后流式细胞仪检测细胞表面标记CD90、CD105、Sca-1的表达水平。成骨诱导实验:将多克隆来源的BMMSCs细胞悬液，以5×104/ml的密度接种于6孔板中，用α-MEM(10%FBS)培养24h，待细胞伸展至60%汇合后，换矿化诱导液(含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml维生素C、1×10－8mol/L地塞米松、100ml/LFBS的α-MEM培养液)连续培养，镜下观察细胞复层生长并出现圆形结节后，继续培至21d，弃原培养液，去离子水反复漂洗，4%甲醛液固定40min，用茜素红染色。成脂诱导实验:将多克隆来源的细胞悬液，以5×104/ml的密度接种于6孔板中，用α-MEM(10%FBS)培养2～3d，待细胞伸展至90%汇合后，换脂肪细胞诱导液(含1mol/LDEC、0．5mmol/LIBMX、10mg/LBPE、100mmol/LIn-domethacin，100ml/LFBS的α-MEM培养液)诱导3d，用含10mg/L的牛胰岛素、100ml/LFBS的α-MEM培养基处理1d，如此循环2次后，再用含10mg/L的牛胰岛素、100ml/LFBS的α-MEM培养基继续培养7d，每隔3～4d换液，4%甲醛液固定，油红O染色。

1．2．3BMMSCs细胞膜片的构建选取对数生长期的荧光大鼠第二代BMMSCs(GFP-BMMSCs)，胰酶消化后吹打成为单细胞悬液。以1×104/cm2的密度接种至50mm一次性培养皿(约1．9×105/培养皿)，十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分散。加入6ml含100ml/LFBS的α-MEM培养液，待细胞生长至约70%汇合时，加入6mlα-MEM培养液(含100ml/LFBS、100μg/ml维生素C，10nmol/L地塞米松)，连续培养2周，并于10d后倒置显微镜下观察细胞复层生长情况。

1．2．4细胞膜片组织学检查及其厚度测量分别取培养1、2周BMMSCs细胞膜片置于4%甲醛液固定，甲酸－甲酸钠复合脱钙液脱钙2～3d，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，HE染色。分别在1、2周细胞膜片的组织学切片中随机选5个点，根据标尺测量其厚度并取平均值，此值即细胞膜片厚度。此部分最少重复5次。

1．2．5细胞膜片RNA的提取和相关因子表达量的RT-PCR检测选取常规培养的第3代GFP-BMMSCs，待其在小培养瓶底面汇合至约80%时，用Trizol裂解并提取总RNA;同时选取培养1周和2周的BMMSCs细胞膜片，冲洗过后用Trizol裂解并提取RNA。测定RNA浓度，分别反转录为cDNA。使用RT-PCR仪测定目标基因TGF-β、colⅠ、VEGF、FGF在样本的表达情况，此部分检测重复3次(表1)。

1．3统计学分析采用SPSS13．0软件包对数据进行处理，结果用x珋±s表示，组间两两比较采用成组t检验，检验水准α=0．05。

2结果

2．1BMMSCs的分离鉴定镜下见分离得到的BMMSCs呈典型成纤维细胞样生长，细胞呈长梭形，有伪足(图1A)。并且可以稳定传代7代以上，具有较高的克隆形成力。具有成骨成脂多向分化能力(图1B、C)。荧光显微镜下见细胞发出绿色荧光(图1D)。流式检测细胞表达骨髓间充质表面标记:CD90，CD105，Sca-1(图E～G)。

2．2BMMSCs细胞膜片形态学观察接种在培养皿中的细胞在含100ml/LFBS、100μg/ml维生素C，10nmol/L地塞米松的α-MEM培养液中连续培养10～11d后，在培养皿底可见一层白色薄膜，边缘可见有轻微卷曲，薄膜与皿底紧密贴附，晃动或倒置均不会脱落。此层薄膜即为细胞膜片(图2A)。镜下见细胞彼此紧靠呈梭形，并重叠生长(图2B)。荧光显微镜下膜片细胞发出绿色荧光(Hoechst衬染，图2C)。继续培养至14d用手术刀片沿培养皿边缘小心刮下膜片，膜片略为皱缩，为乳白色膜状物。有一定的厚度和强度(图2D)。HE染色可见细胞膜片为较为伸展，厚度较为均一的薄膜，其中细胞紧密连接，并有丰富的ECM包裹(图2E)。

2．3细胞膜片的厚度检测分别取培养1周和2周的细胞膜片进行厚度检测。结果显示，膜片的厚度随培养时间而增加，并且在第2周时厚度增加较为明显，从(51．8±3．7)μm增加到(63．1±3．2)μm(图3)。

2．4细胞膜片促愈合基因表达情况目的基因TGF-β、colⅠ、VEGF、FGF在正常培养2周、培养1周和2周的细胞膜片中的表达情况见图4。

3讨论

皮肤作为人体最大的器官，包裹着人体，容易受到内外因素的影响产生创伤、烧伤和溃疡等创面。应用细胞膜片作为创面愈合的“促进剂”有以下优点:①保留了大量ECM和细胞之间的黏附蛋白和表面活性，以及间充质干细胞调节免疫等特殊性质［12］;②无需支架材料，避免了细胞接种导致的损失，以及无法保证材料上的细胞量和支架材料植入产生的炎症反应等［13］;③细胞膜片弹性好，有可塑性，可灵活的调整面积，利于在创面移植，或复合片状敷料后移植［14］。但目前对于BMMSCs以何种机制促进创伤愈合仍不甚清楚。已有报道指出，间充质干细胞发挥其作用有赖于其分泌的大量细胞因子［11］。TGF-β是促进愈合最重要的因子之一。其主要作用在于和FGF协同诱导真皮成纤维细胞增殖迁移并向肌成纤维细胞转化，从而能够大量分泌细胞外基质，推动伤口愈合［14］。此外，TGF-β还诱导伤口处的单核细胞向巨噬细胞的转化，启动炎症过程，促进肉芽形成和创面清理［15－17］。FGF家族因子除能在伤口愈合和组织重构中发挥作用，还能促进再上皮化［18－19］。Real-TimePCR结果显示，经过诱导后TGF-β和FGF在膜片中的表达显著上调(P＜0．05)，说明诱导产生的膜片具备良好的促成纤维细胞增殖和迁移以及启动炎症过程的能力。良好愈合的另一个重要方面是血管化，伤口处的VEGF主要由内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞和巨噬细胞释放，但移植MSC能促进血管化也有深入研究［20］。移植细胞表达的VEGF能在新组织形成时期促进血管长入，缩短愈合时间并提高愈合效率，这也成为目前认为BMMSCs促进愈合的重要方面［21］。RT-PCR结果显示，经过诱导1周的细胞膜片较正常细胞上调VEGF表达(P＜0．05)，第2周稍下降但无明显差别。而Ⅰ型胶原作为ECM的重要成分，既是细胞黏附、血管形成的主要支架和媒介，也是新形成组织的主要成分［22］。在膜片中还作为细胞间相互连接的载体。在愈合过程中，含有大量CollagenⅠ的膜片可以覆盖伤口，作为趋化炎症细胞的“桥梁”，发挥促进炎症和肉芽形成的作用。与肉眼观察一致的是，CollagenⅠ在细胞膜片中的表达显著上调(P＜0．05)，诱导第2周时与第1周无明显差异。综上所述，本实验在分离、鉴定荧光大鼠BMMSCs的基础上，成功构建了BMMSCs细胞膜片并在连续培养2周仍有大量活细胞存在。同时观察到诱导过程中膜片厚度由第1周的(51．8±3．7)μm增加到2周后的(63．1±3．2)μm。诱导第2周的细胞随机排列并重叠生长，细胞充分伸展相互连接紧密，充满ECM。用机械力将细胞膜片刮下后，其呈片状结构较易铺展，有一定的厚度和强度。说明这是一套较为稳定的构建BMMSCs细胞膜片的方法。随后进行的细胞因子表达检测，证明诱导后的细胞膜片高表达TGF-β、FGF、VEGF和ColⅠ等促愈合因子。以上数据为我们构建的GFP大鼠BMMSCs细胞膜片用于皮肤表面创伤的修复奠定了体外实验基础。