产漆酶真菌筛选及其固态发酵条件的初步研究

摘要：目的筛选产漆酶真菌，优化固态发酵培养基组成，研究粗酶的酶学性质。方法平板筛选获得菌株，通过测定漆酶活性优化培养基的组成。结果获得了固态发酵条件下产漆酶活性较高的菌株。优化后培养基的组成：豆粕和木屑比例1∶1，木糖0.5 %，酒石酸铵2.0 %，培养基含水量65 %。漆酶最适温度60 ℃，低于50 ℃时漆酶较稳定，最适pH 3.5，pH 6.5～9.0之间漆酶稳定性较好。结论得到了产漆酶活性较高的菌株，培养基优化后漆酶活性提高7倍。

关键词：漆酶；筛选；固态发酵；粗酶性质

中图分类号：Q554文献标识码：A文章编号：1672-979X(2009)01-0011-04

Screening of Laccase-Producing Fungal Strain and the Preliminary Study on the Solid-State Fermentation Conditions

SHI Xiao-yan1, CAI Yu-jie1, WANG Zhi-xin1, LIAO Xiang-ru1*, ZHANG Da-bing2

(1. The Ministry of Education, Key Laboratory of Industrial Biotechnology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122 China; 2. Hanbon Science & Technology Co. Ltd, Huai’an 223001, China)

Abstract：Objective To Screen the laccase-producing fungi and optimize its solid-state fermentation medium as well as study the property of crude enzyme. Methods The strains wereobtained by plate screening and the optimization of medium was performed by measuring the activity of laccase. Results A fungal strain with a high laccase-producing activity was obtained under solid-state fermentation. The optimal medium contained: soybean meal and sawdust with the ratio of 1∶1, 0.5 % xylose, 2.0 % ammonium tartrate and 65 % moisture. The optimal temperature was 60 ℃ for laccase, and the laccase was stable at less than 50 ℃. The optimal pH value was 3.5, and the laccase was stable at pH 6.5～9.0. Conclusion A fungal strain with a high laccase-producing activity was obtained and the activity of laccase was increased 7 times with the optimization of medium.

Key words：laccase; screening; solid-state fermentation; property of crude enzyme

漆酶（laccase，ρ-diphenol oxidase，EC 1.10.3.2）是一种结合多个铜离子的多酚氧化酶，能催化酚类、芳胺类、羧酸类、甾体类激素、生物色素、金属有机化合物和非酚类物质生成醌类化合物、羰基化合物和水。漆酶与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同源，都属于蓝色多铜氧化酶家族[1]。

漆酶能降解木素，可与有毒的酚类物质作用，还可降解苯氧基类除草剂及去除石油工业废水的毒性。漆酶用于食品加工可提高产量、效率和质量，而且不明显增加投资和生产成本，不产生有毒物质。如：用于提高果汁、果酒和啤酒的稳定性[2,3]；处理食品工业中产生的废水[4]；用于面包加工可增加面包体积，改善面包结构和柔软性，提高面团的机械强度、稳定性，降低面团黏性[5]。漆酶可特异降解木质素，制取膳食纤维，现已取得有实用价值的结果[1]。

自然界中，漆酶分布于多种植物、真菌及少数昆虫和细菌中，分泌漆酶的真菌主要集中在担子菌（Basidimycetes）、多孔菌（Polyporus）、子囊菌（A-somycetes）、脉胞菌（Neurospora）、柄胞壳菌（Po-dospora）和曲霉菌（Aspergillus）等[6]，担子菌纲的白腐菌是漆酶的主要生产者，迄今只发现一种细菌Azospirillum lipoferum能分泌漆酶[1,2]。本研究从自然界筛选能产漆酶的真菌，优化其发酵条件，并初步研究了其酶学性质，以期为今后的研究和工业生产提供理论依据。

1材料和方法

1.1材料

菌种来源从江南大学青山湾校区，无锡市龙山、梅园等地采集大型真菌子实体约40株，从中筛选。

培养基（1）愈创木酚PDA固体培养基：马铃薯20 %，葡萄糖2 %，琼脂2 %，KH2PO4 0.3 %，MgSO4 0.15 %，灭菌后添加愈创木酚0.04 %；（2）液体种子培养基：酵母膏 0.3 %，葡萄糖 2 %，蛋白胨 0.5 %，pH自然；（3）固态发酵初始培养基[7]：豆粕 57.3 %，麸皮38.2 %，葡萄糖0.5 %，（NH4）2SO4 2.5 %，CaCl2 0.48 %，KH2PO4 0.5 %，MgSO4・7H2O 0.5 %，CuSO4 0.02 %。培养基含水量65 %。

1.2产漆酶真菌筛选

将经表面消毒处理的大型真菌子实体组织接种至愈创木酚PDA固体培养基上，30 ℃培养3~5 d，观察菌落周围颜色的变化。挑出产生红色变色圈的菌株，反复分离纯化，直至得到单一菌落。

1.3固态发酵培养

从固体培养基上取一接种环的菌体接入种子培养基（50 mL，250 mL三角瓶），30 ℃、200 r/min摇床培养2 d。取菌悬液接入固态发酵培养基（50 g，250 mL三角瓶），接种量10 %，30 ℃恒温培养。

1.4粗酶液的制备

利用固态发酵产酶，将所得酶曲按1∶5的比例加水，浸泡过夜，8 000 r/min、4 ℃离心得上清，即为粗酶液，4 ℃保存备用。

1.5酶活性的测定

称取1 g湿曲，加入99 mL蒸馏水，室温浸泡2 h，5 000 r/min、4 ℃离心得上清，其他测定步骤与液体测定酶活性步骤相同。

按文献[8]方法进行，以每1 min氧化1 μmol的DMP（2,6-二甲氧基酚）成为3,5,3’, 5’四甲氧基二苯醌（ε= 4 916 mmol-1・L・cm-1）所需的酶量定义为1 个酶活性单位，以U/mL表示，并按U/g湿曲=U/mL上清液×100计算酶活性。

2结果

2.1漆酶高产菌株的筛选

2.1.1初筛将采集的子实体分别编号为lac-1～40，用75 %酒精消毒子实体表面，镊取小块子实体组织接种到加有愈创木酚的PDA固体培养基上，培养3 d后菌体生长良好，lac-1，2，5，7，8，10，13，16，18，21，22，26，29，33，35等的培养皿中，菌体底部及四周有红色变色圈，将菌体挑出划线分离，lac-1，2，5，7，22，26等菌体的颜色较深。

2.1.2复筛为进一步验证菌株固态发酵产漆酶的能力，分别将lac-1，2，5，7，22，26等6株菌接入种子培养基，30 ℃、200 r/min摇床培养2 d转接到固态发酵培养基，30 ℃培养，长出菌体后每天测酶活性。结果见表1。

其中，lac-7固态发酵漆酶活性最高，但是发酵周期过长；lac-22固态发酵周期最短，但是漆酶活性较低。所以最终选用lac-2作为实验菌株，优化其固态发酵条件，并研究其酶学性质。

2.2lac-2初始条件下固态发酵产酶曲线

固态发酵初始培养基30 ℃恒温培养，测定漆酶活性。菌株lac-2在第7天开始产酶，第10天漆酶活性达到最高（1.914 U/g），此后开始下降。因此，确定10 d作为研究培养条件对酶活性影响的适宜时间。

2.3培养条件对lac-2产漆酶的影响

2.3.1不同固体成分及其比例对产酶的影响初始培养基以豆粕为主要成分，分别加入米糠、麸皮、木屑、稻草、高粱杆、水葫芦等。接菌，30 ℃恒温培养10 d测产酶情况，酶活性随培养基中不同固体物质而异，结果见表2。

加入木屑时漆酶活性最高（3.992 U/g），确定豆粕和木屑为固态发酵培养基的主要成分，同时调整豆粕和木屑比例，结果见表3。豆粕和木屑之比为3∶3（1∶1）时，菌体产酶活性最高（6.986 U/g）。

2.3.2培养基含水量对产酶的影响菌体固态发酵生长过程中需要适宜的含水量，但过高或过低都不能满足菌体的生长代谢，在确定豆粕和木屑之比为1∶1的基础上，改变培养基含水量。菌体的产酶能力随培养基含水量的增加而增加，含水量65 %时，漆酶活性最大，进一步增加含水量，产酶能力下降。

2.3.3不同碳源对产酶的影响采用不同碳源（葡萄糖、麦芽糖、果糖、木糖、乳糖、蔗糖），各添加5 %，30 ℃恒温培养10 d测酶活性，产酶情况随碳源不同而异，见表4。添加木糖时漆酶活性最高（8.377 U/g），因此，确定木糖为最佳碳源。

2.3.4木糖浓度对产酶的影响菌体生长前期在培养基中添加一定量的木糖有利于菌体生长和漆酶形成；但添加木糖过多，菌体生长过快，不利于后期漆酶的产生。培养基添加不同浓度的木糖，培养10 d测酶活性，木糖浓度0.5 %时漆酶活性最高。

2.3.5不同氮源对产酶的影响用不同氮源（硫酸铵、尿素、蛋白胨、酒石酸铵、硝酸钾、蛋白胨与硫酸铵混合氮源），各添加2.5 %，30 ℃恒温培养10 d测酶活性，结果见表5。添加酒石酸铵时漆酶活性最高（10.459 U/g），因此，确定酒石酸铵为最佳氮源。

2.3.6酒石酸铵浓度对产酶的影响培养基分别添加不同浓度的酒石酸铵，30 ℃恒温培养10 d测酶活性。酒石酸铵浓度2.0 %时漆酶活性达到13.233 U/g，然后随着酒石酸铵浓度上升而下降。

2.4 漆酶粗酶性质的研究

将酶曲按1∶5加水浸泡过夜，离心，4 ℃保藏备用。

2.4.1温度对漆酶活性的影响pH 3.5环境中，以DMP为底物，测不同温度时的漆酶活性。漆酶活性随温度上升而增加，60 ℃时漆酶活性达到最高，此后随温度升高而下降，主要是因70 ℃以上漆酶失活。

2.4.2漆酶的热稳定性将粗酶液置于不同温度的水浴中保温1 h，pH 3.5、60 ℃时，以DMP为底物测漆酶活性，以初始活性为对照。低于50 ℃时，漆酶稳定性较好。

2.4.3pH对漆酶活性的影响以DMP为底物，60 ℃条件下测粗酶液酶活性。pH 2.5～4.0时活性较高，pH 3.5时漆酶活性最高。

2.4.4漆酶的pH稳定性将pH不同的粗酶液在30 ℃条件下保温过夜，以DMP为底物，60 ℃测漆酶活性。pH 6.5～9.5之间稳定性较好，残存酶活性在80 %以上。

3讨论

固态发酵周期虽较长，但较液态发酵操作简便、能耗低、产物浓度高、回收费用较低。利用豆粕、木屑等废料进行固态发酵，原料成本低，有利于环境保护。添加木糖和酒石酸铵作为碳氮源，有利于菌体生长繁殖和产酶。多数真菌漆酶的最适反应温度较低，一般在25～50 ℃之间。现在也有耐高温真菌漆酶的报道。Jordaan 等[9]从南非的嗜热白腐菌菌株中得到耐高温漆酶，其最适反应温度为70 ℃。杏鲍菇（Plerotus erynhii）漆酶[10]的最适反应温度为60 ℃。多数真菌漆酶的最适反应pH 4.0～6.0，Nina 等[11]研究的子囊菌漆酶最适pH为中性，刘尚旭等[12]报告，糙皮侧耳Ax3所产漆酶的最适pH为2.8。菌株lac-2所产漆酶的最适温度为60 ℃，最适pH 3.5，pH稳定性和热稳定性较好，可广泛用于食品工业、制浆造纸工业、环境保护及生物检测等行业。

参考文献

[1]Alfer M M, Richard C S. Laccase:new functions for an old enzyme[J]. Phytochemistry, 2002, 60: 551-565.

[2]王岁楼，王琼波. 漆酶在食品工业中的应用及产生菌的研究[J]. 食品科学，2005，26（2）：260-263.

[3]Mathiasen T E. Laccase and beer storage[p]. PCT Int Appl WO, 1995, 2124A2.

[4]Duran N, Esposito E. Potential applications of oxidative enzyme and phenoloxidase-like compounds in waste water and soil treatment: a review[J]. Appl Catal B: Environ, 2000, 28: 83-99.

[5]Labat E. Effect of laccase and ferulic acid on wheat flour doughts[J]. Cereal Chem, 2000, 77: 823-828.

[6]Petr B. Fungal laccases-occurrence and properties[J]. FEMS Microbiol, 2006(30): 215-242.

[7]张树江. 固态发酵产漆酶及其应用基础研究[D]. 杭州：浙江大学硕士学位论文，2006：16-34.

[8]康从宝，刘巧，李清心，等. 白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2002，18（5）：638-642.

[9]Jordaan J, Leukes W D. Isolation of a thermostable laccase with DMAB and MBTH oxidative coupling activity from a mesophilic white rot fungus[J]. Enzyme Microb technol, 2003, 33: 212-219.

[10] 兰瑞芳，林少琴，林玉满. 杏鲍菇漆酶的生物学特性[J]. 食用菌学报. 2002，9（2）：14-16.

[11] Nina H, Laura-Leena K, Kristiina K, et al. Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site[J]. Nat Stuct Biol, 2002, 9(8): 601-605.

[12] 刘尚旭，董佳里，张义正. 糙皮侧耳Ax3产漆酶条件及部分酶学性质研究[J]. 四川大学学报，2004，41（1）：160-163.