溶磷真菌PFK―1的解磷能力及其对油菜的促生作用

摘要：利用固体、液体培养法测定溶磷真菌PFK-1的解磷能力；通过盆栽试验，研究其对油菜的促生作用及对土壤磷素变化的影响。试验结果表明，以Ca3（PO4）2为唯一磷源的液体培养基，接种参试菌株PFK-1，在28℃、120 r/min条件下培养144 h溶磷量高达768.1 mg/L；液体培养基中pH值随溶磷量的增加而下降，在144 h时液体培养基pH值降至1.87，以后仍继续保持在低pH值水平；盆栽试验表明，与单施硝基肥的处理相比，1%、2%微生物与硝基肥复配的处理，油菜鲜重和干重增长率分别为7.19%、22.15%和33.11%、40.88%；土壤有效磷分别增加了30.27%、52.36%。

关键词：真菌PFK-1；溶磷能力；促生作用

中图分类号：S154.38文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0085-05

磷是植物生长发育所必需营养元素之一，是植物体内核酸及多种酶、辅酶、ATP等的重要组成成分，在植物生长发育中的作用仅次于氮[1，2]。土壤中95%以上的磷是植物不易吸收利用的难溶性磷，我国土壤中的磷素含量较低，约74%的耕地土壤缺磷[3]，约66.7%严重缺磷[4]。因此，必须向土壤中施入大量可溶性磷肥，以提高作物产量，但当季磷肥利用率较低，约为5%～10%[5]，大部分磷与Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+结合形成难溶性磷酸盐，作物难以利用，使得磷元素在土壤中大量积累，降低磷利用率并带来严重的环境污染。

近年来，利用植物根际与磷循环相关的生物学系统来调节植物根际磷的有效性，特别是利用解磷微生物来活化土壤难溶性磷，已成为提高土壤磷有效性的研究热点[6]。土壤中具有解磷作用的微生物包括细菌、真菌和放线菌等，其中解磷真菌的溶磷能力较强，而且遗传性状相对稳定。具有解磷能力的微生物能够将难溶性无机磷转化为可溶性磷，它们以自身的代谢产物或者与其他微生物协同作用溶解土壤中难溶性无机磷，以提高土壤中磷的利用率、有机质含量、作物产量，改善土壤结构，并减少化肥的施用量，降低农业成本，是增加土壤中可溶性磷的重要途径之一[7]。

本研究对溶磷真菌PFK-1进行了一系列试验，观察其在固体无机磷培养基上溶磷圈大小，测定其对无机磷液体培养基的溶磷能力；在盆栽试验中，研究其对油菜的促生作用以及对土壤中有效磷变化的影响，为利用溶磷菌提高土壤中磷利用率提供一定的参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株溶磷真菌PFK-1，由山东金正大生态工程股份有限公司研发中心微生物实验室分离保存。

1.1.2培养基马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL。用于溶磷真菌的培养。

无机磷固体培养基[8]：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4 ・7H2O 0.3 g，FeSO4・7H2O 0.03 g，MnSO4 ・H2O 0.03 g，Ca3（PO4 ）2 5.0 g，琼脂 20 g，定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。

无机磷液体培养基[8]：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g， KCl 0.3 g，MgSO4・7H2O 0.3 g，FeSO4・7H2O 0.03 g， MnSO4 ・H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，定容至 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

查氏酵母膏琼脂培养基（CYA）：K2HPO4 1.0 g，查氏浓缩液 10.0 mL，酵母抽提粉5.0 g，蔗糖30.0 g，琼脂 15.0 g，无菌水 1 000 mL。

查氏浓缩液配方： NaNO3 30.0 g， KCl 5.0 g， MgSO4・7H2O 5.0 g，FeSO4・7H2O 0.1 g，ZnSO4・7H2O 0.1 g，CuSO4・5H2O 0.05 g，无菌水100 mL。

1.1.3仪器设备主要有Biolog 微生物自动分析系统 （Gen III Microstation 自动微生物鉴定系统）、立式电热蒸汽压力灭菌锅、紫外可见分光光度计、烘箱、空气浴培养摇床、超净工作台、生化培养箱、电子天平。

1.2试验方法

1.2.1固体培养条件下溶磷能力测定将纯化后的溶磷菌株接种于无机磷固体平板上，重复3次。28℃恒温倒置培养7 d测定菌落直径（d）及溶磷圈直径（D），根据溶磷圈直径与菌落直径的比值（D/d）大小初步确定该菌株溶磷能力的强弱，以无溶磷能力的对照菌株为参照。

1.2.2液体培养条件下溶磷能力测定 将供试溶磷菌株接种到PDA平板上，待菌落长满平板后，用直径0.6 cm打孔器取一菌块接种到装有200 mL无机磷液体培养基的500 mL三角瓶中，28℃、120 r/min 振荡培养。分别在24、48、72、96、120、144 h时取出过滤去除菌丝，用钼蓝比色法测定滤液OD700的吸光值及pH值，通过有效磷含量标准曲线计算溶液中有效磷含量，以确定菌株对Ca3（PO4 ）2 的溶磷能力。

磷标准溶液：准确称取0.2195 g经105℃烘干的KH2PO4（分析纯），溶解在400 mL水中，加浓硫酸5 mL，转入1 L容量瓶中，加水定容。此溶液为50 μg/mL 磷标准溶液。吸取该磷标准溶液25 mL，稀释至250 mL，即为5 μg/mL 磷标准溶液。标准曲线绘制参考文献[9]。

1.2.3溶磷真菌形态鉴定及Biolog鉴定将溶磷真菌接种于CYA平板上，25℃倒置培养7 d后，观察菌落外部形态及产孢梗、孢子等性状，参照文献[10，11]进行菌株初步鉴定。

初步确定微生物类型后，在麦芽汁琼脂培养基中进行扩大培养，然后接种到Biolog专用接种液IF-FF中制备成均一的菌悬液，转接到鉴定板上进行培养，培养24、48、72、96、168 h后在读数仪上读取数据，并在 Biolog 数据库中进行相似性比对，查找最接近的结果。

1.2.4溶磷真菌PFK-1对盆栽油菜生长的影响试验将制备好的溶磷真菌孢子粉，按不同配比包裹在（N-P-K）15-6-20硝基肥复混肥颗粒表面，制成微生物包裹型肥料。试验设2个处理，3个对照，重复3次。

处理：T1施用1%微生物包裹型硝基肥1.2 g；T2施用2%微生物包裹型硝基肥1.2 g。

对照：CK0不施肥；CK1施用溶磷真菌孢子粉0.024 g；CK2施用硝基肥1.2 g。

将采自山东省临沭县的农田土（土壤类型为棕壤、质地为砂壤、pH值5.42、有机碳 0.89%、全氮 654.05 mg/kg、有效磷 39.46 mg/kg、速效钾 59.88 mg/kg）在室内风干，粉碎后装入直径18 cm、高18.5 cm的塑料盆中，每盆2 kg。将处理好的肥料与土壤掺混均匀，播种油菜（Brassica napus） 苏州青种子6～8粒，浇水。盆栽从2013年5月14日开始至7月1日收获，共48天，油菜长出2片真叶后间苗定植，每盆2株，于收获时测定鲜重及叶片数，烘干后称干重。

土壤有效磷采用NaHCO3浸提、钼蓝比色法测定 [12]。

试验数据采用Excel 进行处理，SPSS 17.0软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1难溶无机磷固体培养条件下溶磷能力

溶磷圈的大小，是表征溶磷菌相对溶磷能力的一个指标，大致可以说明此溶磷菌分解无机磷能力的强弱，从而可以初步判断溶磷菌溶磷能力。将溶磷真菌接种至无机磷固体培养基平板上，倒置培养7 d后，形成肉眼可见的透明溶磷圈（图1），溶磷真菌菌落直径d=4.5 cm，溶磷圈直径D=8.1 cm，D/d=1.8。表明该溶磷真菌在难溶性无机磷固体培养基上生长良好，其溶磷能力较好。

2.2难溶无机磷液体培养条件下溶磷能力及pH值变化

2.2.1溶磷能力根据1.2.3的方法绘制磷含量与吸光度之间的标准曲线。标准曲线方程为y=1.9095x-0.0014 （R2=1.0000），相关性达极显著水平。根据该标准曲线方程及溶磷真菌培养液的OD值，可以计算出培养液中的磷含量。

无机磷液体定量测磷方法能够更精确地确定溶磷真菌的解磷能力。由表1可以看出，与对照（CK）相比，随着培养时间的变化，培养液中有效磷含量显著增多，培养144 h时溶磷量达到768.1 mg/L，溶磷率达76.8%；总体上，培养时间为24～144 h，液体培养基中有效磷含量随时间增加而增大。

2.2.2不同培养时间液体培养基pH值变化溶磷真菌PFK-1在液体培养基中培养144 h，液体培养基pH值变化过程见图2。从图中可以看出：液体培养基对照初始pH值为7，接种溶磷真菌后，随着培养时间的增加，液体培养基的pH值明显下降，培养144 h时，pH值下降至1.87。

2.3溶磷真菌形态鉴定及Biolog鉴定

2.3.1培养特征观察在CYA培养基上培养7 d后，菌落直径7.4 cm，初期产生白色菌丝，后期形成大量黑色孢子；菌落呈暗黑褐色，菌落丝绒状，中心凸起，有放射状沟纹。菌落背面黄色至黄褐色（图3-A）。

2.3.2显微形态观察挑取适量菌体，制作显微形态观察玻片，在光学显微镜下观察，分生孢子头球形，分生孢子梗无隔膜，顶端膨大形成球形顶囊，直径50～80 μm，在顶囊上生出2层小梗，下面一层是梗基，每个梗基上着生几个小梗，每个小梗顶端生出一串分生孢子。分生孢子球形，直径3.0～4.5 μm，壁粗糙（图3-B）。初步确定供试溶磷真菌PFK-1为曲霉属真菌（Aspergillus spp.）

2.3.3Biolog鉴定结果根据菌株的培养类型，将菌株接种到麦芽汁琼脂培养基上，3 d后用棉签沾起孢子，分散到IF-FF专用接种液中，制备成均一的菌悬液，调整浊度到（75±2）%，接种到FF鉴定板上，接种量 100 μL，26℃培养，在培养24、48、72、96、168 h读取数据一次；培养72 h后，鉴定结果为巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis），PROB为99.8%，SIM为0.76，DIST为4.00。

2.4溶磷真菌PFK-1对油菜的促生长作用及土壤有效磷变化

由表2可以看出，施用溶磷真菌处理能够提高油菜的鲜重与干重，增加土壤有效磷含量，对油菜的生长发育有一定的促生作用。单独施用溶磷真菌的CK1与不施用任何肥料的CK0相比，鲜重与干重均有显著提高，分别增长11.21%和14.09%。而施用硝基肥与溶磷真菌的T1、T2处理与单施硝基肥的CK2比较，鲜重分别增加7.19%与22.15%，干

3结论与讨论

目前已报道的具有溶磷能力的微生物包括细菌、真菌和放线菌等。溶磷真菌种类数量比溶磷细菌少得多，但溶磷真菌溶磷活性均高于细菌[13]。溶磷真菌类主要有青霉菌（Penicillium）、曲霉菌（Asperillus）、根霉（Rhizopus）、镰刀菌（Fusarium）、小菌核菌（Selerotium）等[14]。研究表明，在为数众多的溶磷微生物中，曲霉的溶磷活性最高[15]，溶磷能力在300～400 mg/L之间。本研究中，结合形态鉴定和Biolog自动微生物鉴定系统鉴定，得出溶磷真菌PFK-1是巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）；其具有较强的溶磷能力，在无机磷液体培养基培养条件下，随着培养时间的增加，溶磷量增大；培养144 h时溶磷量为768.1 mg/L，溶磷率达76.8%，这与Cerezine等[16]报道的曲霉在液体培养过程中随着菌丝体的生长，对难溶性磷酸盐的溶解能力逐渐增加相符合。Agnihotd[17]报道一株曲霉在30℃条件下培养20 d，磷矿粉中87.7%的磷可被释放出来。陈明会等[18]从滇池流域富磷区筛选获得的 48 株溶磷真菌对Ca3（PO4）2 有较好的溶磷效果，释放的有效磷含量在14.45～64.87 mg/L 之间，其中黑曲霉 （Aspergillus niger）PSF 47的溶磷能力最好，释放的有效磷含量达64.87 mg/L。

范丙全等[19]在测定溶磷草酸霉菌溶磷圈大小时得出，培养第7 d时D/d值在1.07 ～1.26之间；林启美等[20]测得培养7 d时芽孢杆菌属溶解无机磷的D/d 值范围为 1.14 ～1.43。本研究中，在固体培养条件下，D/d为1.8，表明该株溶磷真菌PFK-1具有较强的溶磷能力。

溶磷真菌在液体中培养时，能够产生草酸、柠檬酸等多种有机酸[21]，从而使pH值降低。赵小蓉等[22]发现溶磷量与培养液中的pH值存在一定的相关性，但培养介质pH值的下降，并不是微生物溶磷的必要条件。本研究中，随着pH值的下降，溶磷量增加，培养144 h时溶液pH值下降至1.87，溶液中有效磷含量最大为768 mg/L，具有一定的相关性。溶磷菌培养液中 pH值下降的原因，可能是因为溶磷菌溶解释放出的游离磷改变了培养液的酸碱度，也可能是溶磷菌本身向周围环境分泌酸性物质或者两者兼而有之[23]。

溶磷真菌能够溶解土壤中的难溶性磷，促进植物对磷素的吸收，从而促进植物的生长和发育。在植物根系接种溶磷真菌不仅可以提高植物吸收磷素，转化难溶性磷为有效磷[24]；也能够促进植物对水分的吸收和利用，提高植物的抗旱能力[25]；还能够增强叶片的光合作用，提高植物的碳素营养， 促进植物生长，增加植物的生物量或干重[26]。本试验中，溶磷真菌PFK-1对油菜有明显的促生作用，能不同程度地提高鲜重和干重，与单施硝基肥的对照相比，处理T1、T2油菜的鲜重和干重分别增加了7.19%、22.15%和33.11%、40.88%；土壤有效磷分别增加了30.27%、52.36%。

溶磷微生物在土壤中存活及溶磷特性受到土壤环境和作物生长等诸多因素影响。本试验中，溶磷菌对油菜生长影响只进行了盆栽试验，虽表现良好，但实验室条件与大田土壤环境条件差异很大，对菌株促生效应发挥有较大影响。所以，验证菌株在大田土壤中的定殖、生长和生存能力应作为后续研究工作的重点。

参考文献：

[1]Sharpley A N. Soil phosphorus dynamics： agronomic and environmental impacts[J]. Ecological Engineering，1995，2（5）： 261-279.

[2]Vassilev N，Vassileva M，Nikolaeva I. Simultaneous P-solubilizing and biocontrol activity of microorganisms potentials and future trends[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，71（2）： 137-144.

[3]席琳乔，冯瑞章. 植物根际解磷菌的研究进展[J]. 塔里木大学学报，2006，18（4）：57-61.

[4]吴平，印莉萍，张立平. 植物营养分子生理学[M]. 北京：科学技术出版社，2001：103-104.

[5]黄伟，黄欠如，胡锋，等. 红壤溶磷菌的筛选及溶磷能力的比较[J]. 生态与农村环境学报，2006，22（3）：7-40.

[6]冯宏，李永涛，张志红，等. 类芦根际溶磷真菌的筛选、鉴定及其溶磷能力分析[J].微生物学通报，2010，37（5）：677-681.

[7]朱颖，姚拓，李玉娥，等. 红三叶根际溶磷菌分离及其溶磷机制初探[J]. 草地学报，2009，17（2）： 259-263.

[8]王义. 热带土壤解磷菌的筛选和种类鉴定及利用的初步评价[D].海口：海南大学，2009：14-15.

[9]鲁如坤.土壤农业化学分析方法[M].北京：中国农业科学技术出版社，2000：166-185.

[10]魏景超. 真菌鉴定手册[M].第一版.上海：上海科学技术出版社，1979： 501- 512.

[11]齐祖同.中国真菌志：第5卷[M].北京：科学出版社，1997.

[12]金继运. 土壤养分状况系统研究法及其应用初报[J ]. 土壤学报，1995，32（1）：84-901.

[13]Kuccy R M N，Janzenand H M， Legett E. Microbially mediated increases in plant available phosphorus[J].Advances in Agronomy，1989，42：199-228.

[14]赵小蓉，林启美.微生物解磷的研究进展[J].土壤肥料，2001（3）：7-11.

[15]Narsian V，Patel H H. Aspergillus aculeatus as a rock phosphate solubilizer[J].Biology and Fertility of Soils，2000，32：559-565.

[16]Cerezine D C，Nahas E，Banzatto D A. Soluble phosphate accumulation by Aspergillus niger from fluorapatite[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，1988，29： 501-505.

[17]Agnihotri V P. Solubilization of insoluble phosphates by some soil fungi isolated from nursery seedbeds[J].Canadian Journal of Microbiology，1970，16：877-880.

[18]陈明会，莫明和，马莉，等.滇池富磷区土壤溶磷真菌的筛选及其对油菜的促生作用[J].农业工程学报，2012，28（S1）：209-215.

[19]范丙全，金继运，葛诚. 溶解草酸青霉菌筛选及其溶磷效果的初步研究[J]. 中国农业科学，2002，35（5）： 525-530.

[20]林启美，赵小蓉，孙炎鑫，等. 四种不同生态系统的土壤解磷细菌数量及种群分布 [J]. 土壤与环境，2000，9（1）： 44-46.

[21]王富民，刘桂芝，张彦，等.高效溶磷菌的分离、筛选及在土壤中溶磷有效性的研究[J].生物技术，1992，2（6）：34-37.

[22]赵小蓉，林启美，李保国.C、N源及C/N比对微生物溶磷的影响[J].植物营养与肥料学报，2002，8（2）：197-204.

[23]梁艳琼，雷照鸣，贺春萍，等.一株溶磷真菌的分离鉴定及其溶磷能力的初步研究[J].热带作物学报，2011，32（6）：1116-1121.

[24]Gulden R H，Vessey J K. Penicillium bilaii inoculation increases root-hair production in field pea[J].Canadian Journal of Plant Science，2000，80（4）： 801-804.

[25]范丙全，金继运，葛诚.溶磷真菌促进磷素吸收和作物生长的作用研究[J].植物营养与肥料学报，2004，10 （6）：620-624.

[26]金术超，杜春梅，平文祥，等.解磷微生物的研究进展[J].微生物学杂志，2006，26（2）： 73-78.山 东 农 业 科 学2014，46（5）：90～92Shandong Agricultural Sciences山 东 农 业 科 学第46卷第5期潘军，等