标记科技在Oxyeleotris marmoratus遗传分析中的运用

云斑尖塘鳢（Oxyeleotris　marmoratus）原产于东南亚，属鲈形目、鱼叚 虎鱼亚目、塘 鳢科、尖 塘鳢属［1］，国内俗称泰国笋壳鱼。该鱼是泰国、越南、马来西亚、印度尼西亚等国主要名贵淡水鱼产品，市场售价超过12美元／kg［2］。由于云斑尖塘鳢肉质鲜美，逐 渐 受 到 我 国 东 南 沿 海 地 区 消 费 者 的 青睐［3］，目前国内市场供不应求，市场价格已达150元／kg；该鱼易于饲养和捕捞［4］，具有非常广阔的养殖推广前景。我国自1986年引进泰国云斑尖塘鳢以来，已完成该鱼的人工繁殖及全套养殖技术［5－6］。目前，国内外对云斑尖塘鳢相关研究主要集中在生态学和养殖技术等［7－10］，而在分子遗传学方面的工作主要是对尖塘鳢属鱼类线粒体12Sr　DNA［11］、16Sr　DNA［12］基因序列的系统分类研究。微卫星标记作为一种分子遗传标记，具有分布广、遗传信息含量高、共显性和便于PCR检测等优点，已成为鱼类种质资源保护、群体遗传结构、生物进化、分类学研究最主要的手段，已广泛用于研究鱼类遗传多样性和遗传结构分析、亲缘关系鉴定、品系家系鉴别、构建遗传连锁图谱和数量性状定位等方面［13－15］。而云斑尖塘鳢微卫星标记的开发与利用目前尚未见报道。笔者采用快速高效的微卫星片段富集技术［16－17］，进行云斑尖塘鳢的微卫星开发，以期为今后云斑尖塘鳢的群体遗传多样性、遗传连锁分析和图谱的构建等方面提供微卫星引物序列，也为云斑尖塘鳢的资源保护和人工繁殖提供基础数据。

1　材料与方法

1．1　材料

云斑尖塘鳢样本48尾由海南断山渔业有限公司提供，体质量50～150g，活体剪取尾鳍保存于无水乙醇中，－20℃长期保存。T4DNA连接酶、Bsp143I内切酶购自Fer－mentas公司，生物素磁珠、PMD18－T载体分别购自Promega公司和Takara公司，大 肠 杆 菌 （Esche－richia　coli）DH5α感受态细胞购自天根生化科技公司，试验所用生物素标记探针、接头及引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1．2　方法

采用改进的FIASCO（Fast　Isolation　by　AFLPof　Sequences　Containing　Repeats）法加以改进筛选微卫星标记，基因组DNA提取 DNA酶切切胶回收连接接头 PCRⅠ磁珠富集PCRⅡ连T载体、克隆同位素二次杂交。

1．2．1　基因组DNA的提取

样品总DNA的提取采用标准的酚／氯仿抽提法加以改进，溶解过夜后取2μL在1％琼脂糖凝胶上电泳检测DNA的质量，并用核酸蛋白仪测其浓度，－20℃保存待用。

1．2．2　文库的构建与阳性克隆的筛选

用限制性内切酶Bsp143I对基因组DNA进行消化后，用1％的琼脂糖进行凝胶电泳，并用DNA胶回收试剂盒回收400～1000bp　DN段，回收片段连接接头AB后进行PCR扩增。反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，65 ℃ 45s，72 ℃ 1min，20个循环；72 ℃ 5min。扩增产物纯化后用磁珠进行杂交洗脱，以DNA洗脱液为模板进行二次PCR，PCR产物用天根试剂盒回收。回收的目的DN段插入PMD18－T载体（D101A Takara）后 转 化 感 受 态 大 肠 杆 菌DH5α（D9057，Takara）。转化的细菌37℃摇床培养1h后涂 布 到 添 加IPTG（0．024 mg／mL）和X－Gal（0．04mg／mL）的氨苄青霉素（0．1mg／mL）LB平板上，37 ℃过夜培养。挑选单个菌落37 ℃培养3～5h后，4℃保存作为PCR筛选的模板。用Primer　RV和Primer　M13进行阳性菌落筛选。PCR体系为10μL，含1μL　10×PCR　buffer、0．8μL　25 mmol／L　MgCl2、0．5μL　2 mmol／LdNTP、0．5U Taq　DNA　polymerase，引 物 各3pmol。94℃预变性5min后，25个循环，每个循环包括94℃变性30s，56 ℃退火40s，72 ℃延伸1min。最后72℃延伸5min。扩增产物在1％琼脂糖胶上电泳，产生500bp以上且单一扩增带的插入片段可进行二次筛选。二次筛选单向进行，引物分别为primer　RV和primer　CA，primer　M13和primer　CA，primer　RV和primer　GA及primerM13和primer　GA。

1．2．3　序列测定及引物设计

将二次筛选后所得的有亮带的菌液送至上海美吉测序。测序结果在Chromas软件上进行峰图分析，在软件SSRhunter上查找微卫星位点，记录下序列的重复模式和重复次数。用Jellyfish软件去掉载体和接头序列后，Primer　5．0软件进行引物设计。

1．2．4　引物筛选及适用性检测

用3尾云斑尖塘鳢的基因组DNA为模板，对扩增条件如Mg2＋浓度、退火温度进行摸索，以扩增产物在1％琼脂糖电泳中出现清晰单一条带且在预期长度左右为标准，找出最适的PCR反应条件，利用筛选的引物对云斑尖塘鳢的48个个体进行PCR扩增，8％的非变性聚丙烯凝胶电泳检测引物的适用性。

2　结果与分析

2．1　阳性克隆的筛选和分析

本试验共挑选了1032个单菌落，第一次筛选得到可能含有微卫星微点的阳性克隆205个（图1），第二次筛选（图2）排除了部分不稳定克隆，最终获得146个阳性克隆测序，其中含有微卫星序列的阳性克隆81个。

2．2　重复序列分布特征

对测序获得的81条微卫星序列进行统计分析发现，重复碱基数大于10的微卫星序列占总数的53．1％。因本试验使用的是（CA）15和（GA）15探针，所检测出来的微卫星序列以CA／GT为最多，占总重复序列的90．1％，其次为GA／CT重复，占总重复序列的6．2％，除此之外，还检测出了少量的以TAC、ATGA、TTCAA为重复单元的微卫星序列。在所 有 的 微 卫 星 序 列 中，根 据Weber的 分 类 方法［18］，Perfect微卫星占64．2％，最大的串联重复次数为24次，长度48bp（H97）；Imperfect微卫星最大长度为157bp（H27）；Compound类型的重复序列，最长的重复长度为36bp（H138）；连续重复序列绝大部分重复次数在5～10次（46．9％），重复次数在20次以上的序列检测到11条（占13．6％），30次以上的重复序列2条（2．5％）。12次重复以上的微卫星序列占50．6％。

2．3　引物的筛选与检测

对设计的38对引物进行筛选，其中的29对可稳定扩增（表1）。这29对引物在云斑尖塘鳢的48个个体中8％丙烯酰胺凝胶电泳的结果显示，除H72表现为单态外，其余均呈现不同程度的多态性（图3），扩增条带2～6条不等，7个位点的多态信息含量在0．5以上，其中以138R、H191多态性最为丰富。观 测 杂 合 度 为0．02～1．00，平 均 值 为0．63。期望杂合度为0．04～0．79，平均值为0．43，遗传多样性较为丰富。有效等位基因数 最多 为4．64个，平均有效等位基因数为2．10个，属中等水平（表2）。

3　讨论

3．1　微卫星标记的筛选

自20世纪80年代中期以来，微卫星标记开始受到广泛关注。筛选方法也由最传统的直接杂交筛选分离法变得越来越多元化。目前我国水产动物的微卫星标记主要通过随机克隆法及磁珠富集法获得，但以磁珠富集法［19］（包括选择性杂交法［20］和FIASCO法［21］）得到的微卫星标记较多。此外，微卫 星 制 备 的 方 法 还 有PIMA［22］和EST－SSR法［23］等。本研究采用可获得高比例完美型序列和高重复序列［24］的磁珠富集法并结合同位素探针进行二次筛选的方法，对云斑尖塘鳢微卫星标记进行筛选，这两种方法结合后的优点是：灵敏度高、目的性强、阳性克隆率高、周期短、一次可获得大量的微卫星 序 列 又 可 较 好 地 避 免 克 隆 库 中 假 阳 性 克隆［25－26］。一般来说，富集文库的阳性克隆率均较高，本研究中测序所得146个阳性克隆中有81个含有微卫星序列，阳性克隆率达55．5％，虽低于顾颖等［27］对大菱鲆（Scophthalmus　maximus）研究中阳性克隆率的96．54％和赵莹莹等［28］对虾夷扇贝（Patinopecten　yessoensis）研 究 中 阳 性 克 隆 率 的98．53％，但相对于采用传统方法得到阳性克隆率的0．04％～12％［21］，具有明显的优势。且本研究所得微卫星序列绝大多数为探针所使用的CA、GA重复，仅有3．7％为非目的克隆，整个过程用时较短，完美型微卫星获得比例高（64．2％）。因此，本方法是一种适合微卫星大规模测序筛选的方法。

3．2　微卫星位点检测

不同物种的微卫星序列的含量、分布及重复类型的丰度等各不相同。真核动物基因组中的二核苷酸微卫星序列（CA）n十分丰富，哺乳动物中每50～150kb就会出现一次［29］；其次为（CT）n重复［30］，三碱基SSR的含量比两碱基的大约低10倍，而四碱基的相对更少［31］。因此，本研究采用生物素标记的寡核苷酸（CA）15、（GA）15作为探针，结果96．3％的微卫星序列与探针序列相符，只是重复长度有所差别，这说明CA、GA在云斑尖塘鳢基因组中广泛分布且含量丰富，且前者明显多于后者。除此之外，本研究还检测出以TAC、ATGA、TTCAA为重复单元的三碱基、四碱基、五碱基重复微卫星序列，说明云斑尖塘鳢基因组DNA中多碱基重复的存在，为进一步研究尖塘鳢属鱼类多碱基重复微卫星开发探针的选择提供一定的依据。微卫星核心序列突变率相对较高，造成了微卫星核心序列重复次数的变化，这是微卫星多态性的基础［32］。Ellegren［33］认为，真核生物中微卫星重复碱基序列重复次数大多在30次以下，且微卫星长度的均衡分布可能是点突变与复制滑移相互间平衡作用的结果，其中重复单元（如非完美型微卫星序列）的随机突变在不同物种重复单元长度变异控制上扮演重要的角色。本研究所得完美型序列（52条）占64．2％，非完美型（27条）占33．3％，由于非完美型多为点突变类型，这些核心序列的突变所包含的种群进化中的遗传信息可作为进一步研究种群系统进化的证据［34］。本研究所得微卫星序列重复次数多集中在5～30次，30次以上的重复序列仅2条，这与Ellegren［33］的研究结果相符，且不会因为核心序列较长而形成二级结构，进而造成PCR效率下降及在电泳分离中造成较大误差，给测序工作带来麻烦［35］。

3．3　多态性分析

不同学者对微卫星核心序列的重复次数定义不一致。Scott等［36－37］对二碱基核心重复序列的定义为7次或7次以上的重复，而本研究采用的是Becker等［38］定义的5次或5次以上的标准。We－ber等［18］指出，只有在二碱基重复次数大于12次时，微卫星标记才有可能出现较高的多态信息含量值，重复次数多的微卫星既能在种间，又能在种内产生多态性，重复次数少的微卫星仅能在种间产生多态性。本研究首次筛选出29对云斑尖塘鳢微卫星引物，其中20对重复次数大于或等于12，这对云斑尖塘鳢遗传多样性分析、种群遗传结构研究均有很高的利用价值，同时也可利用这些引物在塘鳢科鱼类所属的近缘物种中进行通用性研究。

遗传标记的多态性程度一般用有效等位基因数、杂合度及多态信息含量等指标来衡量。杂合度是度量群体变异的一个参数，平均杂合度的大小近似反映出群体遗传结构变异程度的高低。杂合度越高，表明该群体的遗传多样性越高；反之，表明群体的遗传一致性越高［39］。多态信息含量更被认为是衡量变异程度的指标。Bostein等［28］提出，当多态信息含量＞0．5时，该基因座为高度多态基因座；而当0．25＜多态信息含量＜0．5时，该基因座为中度多态基因座；当多态信息含量＜0．25时，则为低度多态基因座。本试验采用29对微卫星引物检测云斑尖塘鳢群体的遗传多样性，结果显示，29对引物中除1对表现为单态外，7对表现为高度多态，14对表现为中度多态，7对表现为低度多态。其中引物138R和H191的多态信息含量值＞0．70，被认为是最理想的微卫星标记［40－41］。有效等位基因数为1．0～4．6，观测杂合度和期望杂合度平均值的平均值分别为0．63、0．43，显示出较丰富的遗传多样性和较高的选择潜力，可以为今后云斑尖塘鳢种群遗传学分析、遗传育种等研究工作提供理论依据和指导。