济宁青山羊微卫星标记多态性分析

摘要：选择位于不同染色体上、具有较高多态性的12个微卫星标记，对济宁青山羊群体的遗传多样性进行研究。结果表明，CSRD247等12个微卫星标记共检测到97个等位基因，每个标记都检测到5个以上的等位基因，平均为8.08个，有效等位基因数为3.1957～6.2113个，基因频率最高的是CSRD247 标记的235 bp 片段（0.4583）；12个微卫星标记多态信息含量（PIC）都在 0.630以上，均为高度多态标记，遗传多样性丰富，其中 SRCRSP5 标记的多态信息含量（PIC）最高，为 0.828，各标记的观测杂合度在0.4286～0.9048之间，期望杂合度在0.5981～0.8397之间，平均期望杂合度为0.7574，属于高度杂合标记和高度杂合品种，遗传变异大。本研究可为济宁青山羊品种的选种、选育及保种工作奠定基础。

关键词：济宁青山羊；微卫星标记；多态性；遗传多样性

中图分类号：S827.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）02-0142-05

济宁青山羊（Jining grey goat）是我国著名的地方山羊品种，2006年被列为国家级畜禽遗传资源保护品种[1]，主要分布在山东省西南地区的济宁、菏泽等地，具有高繁多胎、肉质鲜美、青猾皮轻柔薄暖等优良的种质特性[2]。近年来，济宁青山羊由于受体型瘦小、生长速度缓慢等缺点的限制，与其他品种广泛杂交，纯种处于濒危状态[3]。

微卫星DNA又称简单序列重复，广泛存在于原核和真核生物的基因组中。微卫星DNA 两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，尤其在亲缘关系相近的物种间是保守的，在一些紧密相关的物种中，微卫星DNA的重复单位和重复次数具有一定的相似性[4]，因此，可以利用微卫星DNA作为PCR扩增的靶基因，来鉴定物种之间亲缘关系的远近。同时，在同一物种的不同基因型个体间，微卫星DNA的重复单位数目变异大，因而其长度具有高度的多态性，包含大量丰富的信息，可以作为遗传多样性分析的有效手段。微卫星DNA 标记呈共显性孟德尔式遗传，能够鉴别杂合体，对隐性性状的选择十分有利，不受环境条件和其它因素的影响，表现为中性标记。与其它分子标记（如等位酶、RFLP、RAPD 等）相比，微卫星DNA 标记可检测出更多的等位基因，能够提供更细致的基因变化分析范围，具有极显著的优越性[5]。近年来，微卫星DNA在山羊群体多样性分析、群体遗传结构分析、保种效果评价等方面得到了广泛应用[6-9]，为山羊遗传育种提供了重要依据。为了解济宁青山羊群体的遗传多样性，本研究选择12个微卫星标记对济宁青山羊群体进行检测，统计分析标记的多态性、基因杂合度等，以期了解济宁青山羊群体的杂合程度，为品种提纯复壮、繁殖更新、扩大群体规模奠定基础。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

试验样本采自黄河青山羊保种场（山东省梁山县），随机取12月龄左右济宁青山羊耳组织，每只取5 g，置于装有70%乙醇的灭菌离心管中，-20℃保存备用。共64个样本，试验羊个体间无血缘关系。

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker、PCR Mix等均购自天根生化科技（北京）有限公司。

x器有Eppendorf PCR扩增仪、BIO-RAD凝胶成像仪及电泳系统、ABI 3100-Avant全自动基因序列分析仪、Eppendorf高速台式离心机、NanoDrop 2000分光光度计、电热恒温水槽。

1.2基因组DNA提取

采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取羊基因组DNA，-20℃保存备用。

1.3引物合成与PCR反应体系

参照联合国粮农组织（FAO）及国际遗传学会（ISAG）的推荐，共筛选出12对荧光标记微卫星引物（表1），由鲁生生物技术有限公司合成。5′FAM为蓝色荧光标记，5′HEX为绿色荧光标记，5′TAMRA为红色荧光标记。以羊样本基因组DNA为模板，利用各种微卫星引物进行PCR反应。PCR反应体系为：PCR Mix 6.25 μL，10 mmol/L上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，补水至12.5 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，相应温度退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃延伸5 min。反应结束后，取PCR扩增产物5 μL于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，使用凝胶成像系统进行检测并拍照。

1.4微卫星DNA多态性分析

本研究的微卫星多态性分析采用ABI3100-Avant全自动基因序列分析仪进行。

具体操作步骤：（1）分别取PCR产物、去离子甲酰胺、内标0.5、10、0.5 μL混合，95℃变性5 min，之后用ABI 3100进行分析。（2）其结果用3100 Data Collection软件分析微卫星基因型。其中内标为粉红色。

1.5数据分析

所获数据经前期处理，用POPGEN 1.32计算等位基因数（No）、有效等位基因数（Ne）、基因频率、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）。多态信息含量（PIC）用PIC分析软件计算。

2结果与分析

2.1微卫星DNA多态性分析

对12个微卫星基因座进行PCR 扩增，将其扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示，12个微卫星标记的PCR 扩增产物条带均为一条或两条，符合微卫星标记的基本特征，可用于后续的遗传信息分析。CSRD247检测结果见图1。

利用ABI 3100-Avant全自动基因序列分析仪对PCR扩增产物进行12个微卫星位点共64个样本的分型测定，部分结果见图2。由图2可知，12个微卫星位点的电泳图具有典型性峰形，易于判型，保证了试验数据的可靠性。

2.2微卫星标记的等位基因分析

微卫星位点上的等位基因类型和等位基因频率能够反映群体内的变异程度。经统计得知，CSRD247 等12个微卫星标记共检测到97个等位基因（表2），每个标记都检测到5个以上的等位基因，说明所选择的微卫星标记遗传信息比较丰富。在所有微卫星标记中，以TCRVB6 标记检测到的等位基因数目最多，为11个，其片段大小为 229～252 bp；INRA063检测到的等位基因数目最少，只有5个，片段大小为170～178 bp。

在所有检测到的等位基因中，以CSRD247标记235 bp片段的基因频率最高，为 0.4583，其次是INRA063标记172 bp片段的基因频率（0.4362）；而SRCRSP8标记的 248 bp片段、TGLA53标记的 151 bp片段的基因频率最低，均为0.0104。

2.3多态信息含量与群体杂合度

多态信息含量（PIC）用来描述微卫星标记的变异程度，可用于估计群体内的遗传变异程度，当 PIC>0.50时为高度多态标记，0.25

由表3可知，本研究中的12个微卫星标记均为高度多态标记， 多态信息含量在0.631～0.828之间，说明基因变异较大，济宁青山羊群体遗传多样性丰富，各位点相关性状均未受到强大选择压力的影响，选择潜力较大。

有效等位基因数（Ne）反映了群体遗传变异大小。如果有效等位基因数接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因分布均匀。根据表2、表3中的数据，等位基因观察数和有效等位基因数都相差较大，说明在这些基因座上，群体的等位基因分布不均匀，遗传差异较大，这可能是由地理隔离以及人工选择所造成。

3讨论与结论

微卫星DNA主要分布于非编码区，与分布于编码区的序列相比，由于选择压力较小而变异程度更大。微卫星标记多态性能够反映物种的进化历史，群体中频率最高的等位基因是该物种中最原始、最保守的，其余的等位基因是在进化过程中由该基因突变形成的[10]。如济宁青山羊SRCRSP8基因座的230 bp和232 bp片段就有可能是原始基因，而236 bp和240 bp片段含量极少，极有可能是突变基因。

遗传多样性分析能够反映群体内的遗传变异情况，可以作为群体间遗传关系的划分依据。本研究选用了分布在不同染色体（12个微卫星标记分别分布在 6 条染色体上）上、多态性较高的标记，以尽可能提供较多的遗传信息，且扩增产物片段大小多在115～280 bp之间，便于获得扩增产物和结果统计。12 个微卫星标记均检测到5个以上的等位基因，多态信息含量非常丰富，客观地反映了济宁青山羊的遗传信息。本研究通过对64只济宁青山羊个体12个微卫星座位基因数据的多态信息含量（PIC）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）的分析一致说明：该品种的遗传多样性信息丰富，提供的遗传信息量大，反映出在品种的选育过程中，所用的亲本材料来源广泛，可能与导入了外血、选育时间短等有关。这一结果与近年来由于外来品种（波尔山羊、奶山羊、黑山羊等）引入导致济宁青山羊群体部分遗传资源散失、保种工作滞后致使品种处于濒危状态的现状相吻合。

参考文献：

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山 东 农 业 科 学2017，49（2）：147～150Shandong Agricultural Sciences山 东 农 业 科 学第49卷第2期朱荣生，等：冷藏期间猪肌肉中肌苷酸沉积规律研究DOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.02.031

收稿日期：2016-08-12

基金项目：国家自然科学基金项目（31501928）；山东省农业科学院青年基金项目（2014QNM41）；山东省科技发展计划项目（2015GNC111011）；山东省自然基金项目（ZR2015CM007）

作者简介：朱荣生（1976-），男，山东阳谷人，副研究员，硕士，主要研究方向：动物营养。E-mail：

通讯作者：呼红梅（1976-），女，山东冠县人，副研究员，硕士，主要研究方向：动物营养。E-mail：