骨髓间充质干细胞在软骨组织工程化组织构建中的应用

张 玲 陈长永 综述，王佳琦 审校

人骨髓中所含的细胞可以分为造血类细胞和非造血类细胞。前者中含有的干细胞主要为造血干细胞，而后者中含有间充质类干细胞（mesenchymal sten cell）能够分化为骨、软骨、肌腱、脂肪、皮肤和其他类型的细胞[1-2]。骨髓中含有多向分化潜能的细胞，这类细胞的共同特征是具有成纤维细胞的形态，能黏附塑料培养皿，并能形成细胞克隆，但无吞噬功能。基于这些特征，这类细胞又被称之为“成纤维细胞样的克隆形成单位”或“骨髓间质纤维细胞”。随后的研究发现，在适当的实验条件下，骨髓间质纤维细胞能够形成软骨、骨、脂肪、纤维组织和骨髓间质组织等[3]。由于MSC主要存在于骨髓中，故骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell）或骨髓间质细胞（bone marrow stromal cell）的英文缩写BMSC已成为一种较为常见的命名方式。理想的软骨组织工程种子细胞应具备以下特点：易获取、对机体损伤小、易体外培养增殖、长期传代不改变生物学特征、具有较强的传代繁殖力、组织修复能力强、植入体内后能耐受机体免疫、并保持良好的生物相容性。来源于自体骨髓的间充质干细胞完全具备这些特点[4-5]。随着对BMSCs研究的不断深入，BMSCs用于医学领域的巨大潜能逐渐被发掘出来了。本文就骨髓间充质干细胞在软骨组织工程化组织构建中的应用进行综述。

1BMSCs定向诱导分化为软骨细胞的方式

目前，国内外BMSCs定向诱导为软骨细胞的方式很多，大体可分为体外和体内两种诱导方式。

1.1 体外诱导：体外诱导包括体外细胞团聚集诱导、体外单层细胞团诱导、体外三维支架环境中诱导与软骨细胞体外共培养诱导。

1.1.1 体外细胞团聚集诱导：在软骨发育过程中，前期细胞密度较大，后期细胞密度逐渐降低，所以Brian,Yoo JU[6-7]等把兔BMSC先在含10％DMEM中培养后，消化收集融合的BMSCs，低速离心后移入l5ml聚丙烯试管中，用含10mol/L地塞米松DMEM培养液聚集诱导培养，在7天既检测到细胞团中有Ⅱ型胶原的分泌；21天细胞团形态类似软骨组织，体积约2mm3，所有细胞聚集团均有软骨特异性Ⅱ型胶原分泌，并部分检测到X型胶原的表达，而不加地塞米松的对照组则无Ⅱ型胶原表达。在DMEM培养液中同时加入TGF-β1时，诱导出的类软骨组织团体积比前者大。以上研究初步证实TGF-β1、地塞米松在BMSCs向软骨细胞分化过程中起着重要作用[8-10]，而研究者所采用细胞聚集成团诱导，正是模拟了人体内软骨发育时的过程，先在将要形成软骨的部位，中胚层的问充质细胞聚集形成前软骨细胞团，进一步分化为软骨细胞。细胞聚集成团，形成内部相对缺氧的环境,可能会有利于BMSCs向软骨细胞分化。

1.1.2 体外单层细胞诱导：体外细胞团聚集诱导培养形成基质后，可能因为周边细胞营养充分，细胞团外基质分泌较旺盛，细胞团中心部位细胞由于营养弥散受限而易发生坏死，而且细胞团聚集诱导形成的软骨样组织体积非常小，一般仅约2～5mm3，其临床实用性非常有限，根本无法满足软骨缺损修复或体表凹陷缺损的充填，而体外单层诱导培养有可能获得更多的细胞。Worster[11]等在体外单层培养环境中，对马的BMSCs单层诱导培养，检测到软骨细胞特异性II型胶原，初步证实马的BMSCs经单层诱导培养已有部分细胞向软骨细胞分化。Gallay[12]等用含有β1 转化生长因子（TGF-β1）的培养基培养骨膜MSCs后发现有软骨细胞形成。Mackay[13]等将人的BMSCs置入含有地塞米松、TGF-β1的培养基中培养14天后，细胞开始分泌Ⅱ型胶原，说明BMSCs已分化为软骨细胞。夏万尧等以高糖DMEM低血清含有TGF-β1，地塞米松、胰岛素等诱导因子作为诱导培养液，在体外单层培养条件下，诱导猪BMSCs向软骨细胞表型定向分化，诱导培养后7天免疫组化检测到II型胶原，原位杂交也检测到II型胶原mRNA表达；而对照组则不能测到II型胶原的表达。实验证明BMSCs在体外单层培养诱导下，也能向软骨细胞分化。Sekiya[14-16]等证明，在含有地塞米松、TGF-β1的培养体系中再加入骨形态发生蛋白-6（BMP-6)会使细胞微团的重量增加10倍以上，产生的基质也更多。Mastrogiacoma[17]等的实验证实，成纤维细胞生长因子2(FGF2)使BMSCs保持在一种不成熟的状态中，并有强烈的促增殖作用，同时可诱导MSCs分化成软骨细胞。

1.1.3 体外三维支架环境中诱导：因为体内细胞都是在三维空间中生长、繁殖、分化并发挥其特定的生物学功能的，在用组织工程技术构建软骨或修复的过程中，细胞支架可模拟机体的状态，提供一个稳定的三维空间支架结构，并保持足够的空隙率，供细胞在其中附着、分化、增殖、物质交换、生长代谢，引导软骨组织形成，并为细胞自分泌或旁分泌的细胞因子提供暂时的附着点。U1rich[18]等以包埋后聚羟基乙酸(PGA)为载体，在体外应用含TGF-β1，特定培养液定向诱导人BMSCs，结果证实有软骨样组织形成，并在蛋白和分子水平检测到软骨细胞分泌的II型胶原、IX型胶原。夏万尧[19-20]等以猪髂骨骨髓中分离得到的BMSCs体外低糖DMEM完全培养液培养2周，传代后以浓度为5×107/ml细胞悬液均匀接种于管状PGA支架上，以高糖DMEM低血清特定培养液诱导，连续诱导培养lO周时，BMSCs-PGA复合物外观呈乳白色软骨样，管壁较厚,有一定的弹性，但中间部管腔塌陷较明显，HE染色见实验组管状BMSCs-PGA复合物表层为2～4层成纤维样细胞样组成的软骨膜，下层为较成熟的软骨组织，软骨细胞均匀分布，包埋在软骨陷窝内，结构较致密和规则，免疫组化也证实在形成的软骨基质中有大量被特异性染成棕黄色颗粒的Ⅱ型胶原分布；而对照组管状BMSCs-PGA完成解体，仅剩一层薄薄的膜状组织。此研究结果表明利用BMSCs为种子细胞，复合管状PGA支架，应用特定的培养液可在体外构建管状软骨，这对将来临床应用BMSCs作为种子细胞，修复软骨缺损或构建复合组织气管具有一定的应用前景。王会才[21]等观察微重力条件下动态三维诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化!并与静态培养作比较得出结论：立体诱导优于平面诱导，微重力动态培养可提高细胞诱导分化质量。

1.1.4 与软骨细胞体外共培养诱导：许多研究证实软骨细胞可分泌多种对BMSCs有诱导作用的生长因子如TGF-β、IGF及CDMP等。苗春雷[22]等应用软骨细胞和BMSCs以8∶2的比例混合接种在PGA支架上体外共培养，能诱导BMSCs分化为成熟的软骨细胞并形成软骨组织，组织学显示有较连续的成熟软骨形成，有大量成熟的软骨陷窝，免疫组化证实有II型胶原分泌。而对照组应用单纯相同数量BMSCs在体外仅形成纤维样组织，单独应用相同数量的少量软骨细胞与同体积生物材料混合接种培养，也只能形成极少量的不连续的软骨组织，明显少于共培养组，说明去除软骨细胞的诱导作用后，BMSCs不能单独在体外形成成熟的软骨组织，而且软骨细胞量太少时，也只能形成极少量的软骨组织。从这实验结果可以推测在体外共培养过程中，由于BMSCs与软骨细胞的充分接触，软骨细胞分泌多种诱导因子如TGF-β1、IGF及CDMP等有可能以旁分泌方式作用于BMSCs，诱导其向软骨细胞表型分化，同时BMSCs也暴露于软骨细胞分泌的特异性细胞外基质如Ⅱ型胶原。软骨特异性细胞外基质和软骨细胞膜表面分子也可能在诱导大量BMSCs向软骨细胞分化并在体外形成软骨起重要作用，说明软骨细胞是一个良好的诱导因素，能有效地诱导BMSCs向软骨细胞分化。

1.2 体内诱导：体内诱导包括体内软骨微环境诱导和基因转染诱导。

1.2.1 体内软骨微环境诱导：关节软骨再生主要靠缺损周围软骨细胞分泌或关节滑液中含有的多种因子，使迁移到缺损处的间充质干细胞，在局部合适的软骨微环境中，再加上关节活动时的力学刺激，被诱导为软骨细胞并修复软骨缺损。董启榕[23]等将兔BMSCs细胞体外增殖后与II型胶原凝胶混匀，植入到兔股骨滑车关节面上软骨缺损处，直径3mm、深度3mm达骨髓腔；对照组为单纯Ⅱ型胶原凝胶，4周后实验组缺损处可见透明软骨样组织充填，l2周后缺损处软骨及软骨下骨大部分得到修复，边界清楚，表面稍不平整。而对照组缺损主要为纤维样软骨修复为主，这说明BMSCs和II型胶原凝胶的复合物，在关节软骨原位修复时，即使没有体外诱导的过程，在关节微环境诱导诱导条件下，也能部分修复关节软骨。

1.2.2 基因转染诱导培养：近年还发现BMSCs不仅具有多向分化潜能，还易于外源基因的转染并能稳定表达外源基因，因此利用基因工程方法将主要诱导因子基因转入BMSCs，使外源基因在一定时期内能高效表达，植入体内后能通过自分泌或旁分泌途径来表达目的诱导因子，进一步促进其分化和维持表型稳定，从而弥补由于突然失去体外诱导培养液中的高浓度诱导因子的诱导作用而发生“反分化”。郑启新[24]等应用真核表达载体pcDNA3，1-TGF-β1转染BMSCs，可使BMSCs有效表达活性TGF-β1达3周；在此研究的基础上，郭晓东[25]等进一步用真核表达载体pcDNA3，1-TGF-β1转染的BMSCs作为种子细胞，体外培养后接种到多聚赖氨酸包埋的聚DL乳酸可降解多孔材料(PDLLA)，修复同种异体兔关节软骨缺损，修复后24周，实验组新生透明样软骨表面平整，软骨下骨再生，与邻近新骨、软骨结合紧密，新生组织周围仅有少量的中性粒细胞浸润。说明转基因的BMSCs植入体内后，可能使BMSCs的hTGF-β1自分泌、旁分泌功能显著加强，通过在缺损处局部形成有效hTGF-β1的浓度，表层的BMSCs在关节腔内低氧压力以及关节应力的环境下，向软骨分化。付勤[26]等应用TGF-p。和IGF-l基因转染大鼠BMSCs后大鼠BMSCs原代细胞接种24 h后可见少量贴壁突起细胞，4、5 天开始形成典型的BMSCs簇状增生9、10天细胞生长即可达80％～90％融合；传代后细胞形态较均一免疫荧光法检测BMSCs的CD29、CD44呈阳性反应，CD34、CD45呈阴性反应。TGF-β1和IGF1基因共同转染BMSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向，对组织工程软骨应用于临床具有重要意义。

2BMSCs应用于软骨组织工程中存在的几个问题

2.1 BMSCs构建的软骨组织工程化组织较正常软骨形态、生物力学性能存在差异：Wakitani等1994年首先报道了用体外纯化培养的自体骨髓MSCs掺入I型胶原凝胶修复兔膝关节软骨大的全厚缺损，术后2周即形成透明软骨，24周缺损的关节软骨和软骨下骨得以修复，但修复的软骨比正常关节软骨薄，有些区域缺乏软骨蛋白多糖着色。与周围软骨融合仍不完全．力学测试结果低于正常软骨，而采用来源于骨膜BMSCs的效果更差。 1996年Miriam等以高密度培养诱导软骨细胞表型后，将BMSCs掺入2%的高分子量透明质酸进行自体移植修复羊膝关节软骨缺损，3个月后形成了组织结构与正常关节软骨相似的透明软骨。但形态结构仍有差别，其最终的转归还需更长时间的观察。可见，虽然骨髓间充质干细胞体外诱导性培养和体内关节软骨的修复均能有效地生成软骨，但只能达到组织形态及生化成分上类似，不能实现与原有软骨相同的再生。因此目前尚无组织工程学方法能高质量地修复软骨缺损并获得很好的远期疗效，要成功产生关节软骨还需进一步模拟骨髓间充质干细胞向生理状态下软骨分化的调控。

2.2 如何调控BMSCs定向分化成软骨细胞，使其分化的初级软骨细胞分化为成熟软骨细胞，并抑制其向肥大软骨细胞分化，这也是目前软骨组织工程学中的重要问题。这需要更深入的研究了解BMSCs分化机制。从而指导调控。

2.3 适合于BMSCs的组织工程基质材料同样是目前研究的难点：理想的软骨组织工程基质材料应具备以下特点：①良好的生物相容性：其本身或降解产物对种子细胞和机体无毒性，不会引起炎症和免疫排斥反应；②良好的生物降解性：降解速度需和组织再生速度相匹配，最后可完全吸收；③ 具有三维多孔立体结构。④可加工性和有一定的机械强度；⑤良好的材料－细胞界面；⑥良好的消毒性能[27]。常用的软骨组织工程基质材料按其来源可分为人工合成和天然材料二大类。合成材料主要有：聚羟乙酸(PGA)、聚乳酸(PLLA、PDLLA)、聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(PL－GA)、透明质酸(HA)、藻酸钙凝胶、聚氧乙烯水凝胶、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(Pluronic)、聚丙烯延胡索酸盐(PPF)、聚酐、聚磷酸酯等。天然材料有胶原(I或Ⅱ型)、纤维蛋白凝胶、硫酸软骨素、脱钙骨基质(DBM)、明胶等[27-28]。这些基质材料各有其优缺点。其中PLGA、HA、Pluronie、PGA/PLLA、PDLLA等在软骨组织工程研究中显示了良好的性能而被广泛接受。

2.4 BMSCs作为软骨组织工程种子细胞存在的医学伦理问题：从患者骨髓穿刺获取骨髓问充质干细胞，经体外诱导分化为软骨细胞，用于修复软骨缺损等，与多次切取自体软骨组织移植相比，患者更愿意接受。间充质干细胞由于是自体细胞经过体外扩增诱导后重新回植，所以病人更容易在心理上接受，涉及的伦理道德问题也较少，因此已成为组织工程软骨组织种子细胞的主要来源[29]。

3BMSCs在软骨组织工程化组织构建中的应用前景

正是由于BMSCs具有良好的多组织分化潜能和高增殖活性，获取方法简便易行。便于自体移植．故在组织工程领域展现了其良好的应用前景。但就软骨组织工程而言。有关BMSCs在很多方面还需要进一步研究。一些基本的问题需要给以准确的回答。例如．BMSCs经体外大量扩增后如何能很好地保持多能干细胞的生物学特性；BMSCs分化为软骨组织，是软骨内成骨的中间过程还是终极分化；BMSCs的软骨细胞表型分化和维持的关键外部刺激信号和信号传导途径等等 随着BMSCs各方面研究的不断深入。相信在不久的将来它很可能成为组织损伤修复的有力工具。

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[收稿日期]2008-11-10[修回日期]2009-01-08