幽门螺杆菌对食管癌COXⅠ表达的影响

[摘要] 目的 观察幽门螺杆菌（H. pylori，Hp）作用于食管癌细胞后细胞色素氧化酶Ⅰ（cytochrome oxidaseⅠ，COXⅠ）mRNA及其蛋白表达的变化，探讨Hp在肿瘤发生发展中可能的作用机制。 方法 将Hp与食管癌细胞分别作用4、8、24 h，收集细胞，应用Real-Time PCR和Western blot法检测各时间点COXⅠmRNA及其蛋白表达。 结果 Hp与食管癌细胞共培养4、8、24 h后，COXⅠmRNA表达量逐渐减少，4 h的表达量显著低于对照组，其后下降速度减慢，24 h后表达量不再有明显改变。COXⅠ蛋白表达呈现相似的趋势。 结论 Hp与食管癌细胞共培养后，可导致线粒体编码基因COXⅠmRNA及其蛋白表达障碍，从而影响线粒体功能。

[关键词] 幽门螺杆菌；食管癌上皮细胞；线粒体；细胞色素氧化酶Ⅰ

[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（a）-0008-03

自从幽门螺杆菌（Hp）被分离培养成功以来，其与消化系统疾病的关系已引起国内外学者的广泛关注。Hp在体内长期定植可以造成上皮细胞直接损伤，最终导致消化性溃疡和肿瘤的发生[1-2]。Hp已被WHO宣布为Ⅰ类致癌因子[3]，但其致病机制并不明了。现有报道称Hp的空泡细胞毒素（vacuolating cytotoxin，VacA）可通过线粒体途径诱导细胞凋亡[4-5]。Hp感染可引起线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）片段与核基因组的整合，并参与胃癌的发生[6-8]。既往的研究提示线粒体途径在Hp的致癌机制中占有重要作用，为了进一步明确这一问题，笔者观察了Hp对线粒体编码基因细胞色素氧化酶Ⅰ（COXⅠ）mRNA 表达的影响，希望能较深入地探讨线粒体损伤在Hp致癌中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

食管癌细胞株ECa-109购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，Hp（NCTC11637）菌种由浙江大学严杰教授赠送；RMPI 1640、小牛血清购自GIBCO；Hp添加剂（SR0147）、哥伦比亚血琼脂、厌氧袋、微需氧产气袋均购自英国Oxoid；Trizol试剂、抗小鼠IgG-HRP购自Sigma公司；逆转录试剂盒（DRR036A）、Real-Time PCR试剂盒（DRR041A）均购自日本TaKaRa公司；COX-Ⅰ单克隆抗体购自Mitosciences公司；RIPA细胞裂解缓液购自上海申能。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 ECa-109在含10%灭活小牛血清，100 μ/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RMPI1640培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中完全培养，细胞2 d换液，85%汇片时传代。

1.2.2 细菌培养 将Hp接种于含5%脱纤维羊血和Hp添加剂的哥伦比亚血琼脂平皿上，立即置厌氧袋中，并加入微需氧产气袋，于37℃培养箱中培养，3～5 d后观察结果，经肉眼观察菌落形态、革兰染色和尿素酶试验等生化实验证实为Hp。用含10%小牛血清的无抗生素RMPI 1640培养液制成细菌悬液，分光光度计上测定细菌浓度。

1.2.3 细菌细胞共培养 将ECa-109细胞以3×105的密度接种于6孔细胞培养板，于37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h，实验组换上Hp细菌悬液，放于细胞培养箱共同培养中，混合后使细菌/细胞比例为100∶1，分别培养4、8、24 h。对照组换上含10%小牛血清的无抗生素RMPI 1640培养液。

1.2.4 Real-Time PCR反应引物 根据GenBank 中的人线粒体基因组序列（NC_012920）应用 Beacon Desinger 7.9设计COX-Ⅰ引物，由上海捷瑞生物有限公司合成。PCR引物序列为，COX-Ⅰ：5′-CTGACTGGCATTGTATTAG-3′， 5′-ATTGATAGGACATAGTGGAA-3′；内参GAPDH：5′-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3′，5′-GGTGGAATC ATATTGGAACA-3′。

1.2.5 Real-Time PCR反应体系、条件及mRNA表达量的计算 Trizol试剂抽提细胞总RNA。逆转录用的是日本TaKaRa 公司的PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒（DRR036A），按说明书操作。反应条件是37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。PCR扩增用的是日本TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒。运用Stratagene Mx3000P Real Time PCR扩增仪。扩增条件按说明书设置。每一反应设3个复孔。样本中目的基因mRNA的相对表达量=2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，ΔCt=Ct COXⅠ-CtGAPDH）。

1.2.6 Western-blot分析 收集培养的细胞，PBS洗涤3次，按1.5×106个细胞加入150 μL RIPA细胞裂解缓液，冰上放置25 min，于4℃ 12 000 g离心5 min，取上清， BCA法蛋白定量。在100℃煮沸5 min变性，制备20%分离胶、10%浓缩胶，取50 μg 蛋白加入上样缓冲液上样，电泳，转至PVDP膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，TBST洗涤，加入小鼠抗COX-Ⅰ单克隆抗体 （1 μg/mL）， 孵育2 h，洗涤后后再加二抗抗小鼠IgG-HRP，室温反应2 h，ECL化学发光法显影。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0软件进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hp对食管癌细胞COXⅠmRNA表达的影响

Real-Time PCR结果数据见表1，可以看出共同作用4 h后表达量明显下降，与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），此后下降速度减慢，作用24 h后表达量不再有明显改变。

2.2 Western-blot检测COXⅠ蛋白的表达变化

食管癌细胞ECa-109与Hp共培养4 h后，COXⅠ蛋白的表达显著下降，此后下降速度减慢，作用24 h后表达量不再有明显改变（图1）。

3 讨论

过去的十年，众多的研究团队已经证明了在多种人类肿瘤中存在线粒体DNA突变或基因表达异常的现象[9-10]。介于线粒体在能量合成、凋亡、细胞增殖等方面都有重要作用，一旦其发生突变、功能受损，将影响细胞的生物学行为， 使其发生恶变[11-12]。COX在呼吸链氧化磷酸化过程中有重要作用，其损伤可直接影响线粒体功能[13-14]。COX由13个亚基组成，其中最大的3个亚基（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）是由mtDNA 编码，并且在线粒体中合成，其余亚基由核DNA编码，其表达的改变直接反映了线粒体的功能[15]。Hp已被确认为第Ⅰ类致癌因子，但其致癌机制不明。国内外的研究表明Hp可通过线粒体途径致胃黏膜细胞损伤，诱导细胞凋亡，凋亡和增殖失衡，导致胃癌发生。Hp可能通过线粒体机制诱导肿瘤的发生。本研究表明食管癌细胞与Hp共同作用4 h后，其COXⅠmRNA 表达量开始下降，此后下降的速度减慢，作用24 h 后其表达量呈较稳定的状态。蛋白表达的改变有相同的趋势。结果表明在Hp的作用下可使mtDNA 编码的COXⅠ转录活性降低，蛋白表达减少。这一结果与其他文献报道结果一致。笔者先前的研究发现在食管癌与Hp感染相关[16-17]。现在观察到的这一现象进一步说明了Hp感染可能在食管癌的发生发展中有一定作用。

Hp可抑制食管癌细胞线粒体编码基因COXⅠmRNA的表达，从而影响线粒体功能，此项研究结果为进一步揭示Hp致癌的分子机制提供新的线索。

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（收稿日期：2012-03-01 本文编辑：郝明明）