福建省分离的HIV-1 Thai-B亚型感染性克隆的构建及序列分析

中国自1985年出现第一例艾滋病病人以来[1],20多年来艾滋病流行经历了传入期、播散期和快速增长期三个阶段,全国 31 个省、市、自治区均有病例报告。截至2009年底,估计中国目前存活艾滋病病毒感染者和病人(HIV/AIDS)约74万人。最新的分子流调结果显示,我国目前流行的主要毒株是Thai-B(44%),C(29%,主要为 CRF08_BC)和 CRF01_AE (13%)其中 CRF07_BC 和 CRF08_BC 是中国特有的流行毒株,是由 Thai-B 亚型和 C 亚型重组而成,而且 Thai-B 亚型已经取代了欧美 B 亚型(prototype B)成为我国流行率最高的病毒亚型[2-4]。Thai-B亚型最早是发现于泰国曼谷的静脉吸毒人群,与欧美B亚型相比,两亚型的膜区序列聚集在一起,可是又位于不同的进化树分支上,故又被命名为Thai-B亚型,其主要特征是在Env基因的V3 loop区存在14(I-L)、22(F-W)和28(D-Q)的氨基酸置换[5]。目前该亚型除了在泰国传播流行外,还在亚洲其他国家如中国,马来西亚,日本等地传播并成为当地的主要流行毒株。

自1986年Adachi 通过噬菌体克隆首次获得HIV的感染性克隆pNL4-3成功构建以来[6],感染性克隆构建技术得到不断的完善,迄今为止,构建成功的感染性克隆已经涵盖数种亚型,包括A,B,Thai-B, C,D,O,AG,AE,BC,D/C等亚型[7-20],其中绝大部分是流行于欧美的B亚型毒株。在针对流行于中国的HIV-1病毒构建的感染性克隆研究中,有报告的仅有2株,其中1株来自新疆静脉吸毒人群中的病毒,为CRF07_BC重组亚型[20],另1株是来自河南卖血人群中的病毒,为Thai-B亚型[10]。这两毒株来源均具有独特的区域代表性。为了进一步了解Thai-B亚型毒株的一些生物学特性及该亚型在福建省可能的传播途径,也为构建表型耐药检测提供必要研究工具,我们在前期研究基础上选取一株可持续传代、快/高复制、T细胞噬性的合胞体诱导株进行全长基因组序列分析,并在此基础上构建感染性克隆。

1材料与方法

1.1 毒株来源

由福建省疾病预防控制中心确认并分离的HIV-1毒株lwj,该毒株分离于一名患隐球菌性脑膜炎的艾滋病患者,自称是经输血/血制品感染。经异源双链泳动分析及小片段DNA序列测定鉴定为Thai-B亚型,该毒株可以在原代人PBMCs和传代人T淋巴细胞系(MT4)上复制并导致细胞病变(CPE),为可持续传代、快/高复制、T细胞噬性的SI毒株[21]。

1.2 plwj全长基因组克隆的构建

用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)提取病毒感染细胞中基因组DNA。根据参考序列设计两对前后半长引物,应用Expand long template PCR system ( Roche),使用热启动技术进行长片段PCR扩增,5’前半长片段扩增引物是:5’-LTR (5’-TGGATGGGCTAATTTACTCCAAGAAAAGACAAG-3’) 和Half-vif (5’-CCTTTTCTCCTGTCTGCAGACCCCAATATG-3’),其扩增区域为5’LTR到 vif 约5.2kb;3’后半长片段扩增引物是:Halfs-wai (5' CGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACC 3')和 3’-LTR5’-TGCTAGAGATTTTTACTCAGTCTAGAG(TGGT

CTGAG-3’),其扩增区域为vif 到 3’LTR约4.8kb,其前后半长在vif区有部分重叠。PCR 反应条件:94℃ 2 min,1 个循环;94℃ 10 sec,57℃ 30 sec,68℃ 5 min50 sec,10 个循环;94℃ 15 sec,57℃ 30 sec,68℃ 5 min 50 sec,20个循环,每个循环递增5 sec的延伸时间;68℃ 10 min。采用特殊的凝胶纯化试剂(结晶紫),混合3次扩增样品在可见光下进行切胶纯化。用TOPO XL PCR Cloning Kit(Invitrogen)试剂盒,将lwj前后半长PCR 纯化产物克隆到pCR-XL-TOPO T载体上,构建plwj-5’half 和plwj-3’half前后半长重组质粒。采用PCR 法对转化获得的单菌落进行快速筛选,挑出阳性克隆并进一步酶切和 DNA测序鉴定。对前后半长基因序列进行酶切图谱分析,在前后半长Vif重叠区域找到AarI单一酶切位点,并利用载体上多克隆位点处限制性内切酶BamH I ,分别酶切plwj前后半长重组质粒,用 T4 DNA 连接酶将酶切后的lwj-3’half片段 与plwj-5’half 载体进行连接。连接产物转化DH5α感受态细菌。采用菌落PCR 法进行快速鉴定挑出阳性克隆并进一步用BamH I/NotI双酶切鉴定以筛选出正确的全基因组克隆,整个克隆构建策略见图1。

图1plwj全长基因组克隆构建策略

1.3 plwj全基因组克隆转染 293T 细胞产生衍生病毒

利用脂质体转染法将阳性克隆plwj转染293T细胞,培养72h后,离心,转染上清经 0.45-μm过滤后进行 HIV-1 p24抗原检测(Vironostika HIV-1 Antigen P24 Micro-ELISA System),以确定有无产生衍生病毒。

1.4 plwj全基因组克隆感染活性的鉴定

plwj全基因组克隆转染上清(即衍生病毒)经0.45-μm过滤后用 p24 定量检测试剂盒定量至 80ng/ml病毒,用 1.5ml 的病毒上清感染 3×106经PHA-P 刺激活化的正常 PBMCs,孵育 4-5h,离心弃上清,细胞用 10ml Hank’s 洗两次后吸干上清以去除残留的 p24 抗原。用 8ml 新鲜的T淋巴细胞生长液重悬细胞后置 37℃,5% CO2条件下培养12d,每隔3-4d 移去4 ml培养上清液,随之补充4 ml新鲜的培养液,其中在第6d 补充3×106个经PHA-P激活了的正常的PBMCs。收集感染上清进行 p24 抗原检测鉴定衍生病毒对 PBMCs的感染性。以上转染及感染实验在同等条件下重复两次。

1.5 感染性克隆plwj全基因组序列分析

将感染性克隆plwj送交上海生工进行测序,使用Primer walking方法进行全基因组测序。将全长序列提交HIV databases 库,利用其Sequence locator Tool进行序列定位。测得的序列用DNA STAR软件进行编辑、校正后,使用clustal X软件与HIV-1M组各亚型参考毒株序列进行多重排列、比较和同源性分析;用Bioedit软件将序列长度编辑一致并进行格式转换后,利用Mega软件中neighbor-joining(N-J)method进行系统进化树的构建,进化树的可靠性使用Bootstrap分析,重复1000次。利用RIP 3.0软件进行序列重组分析。整理后的序列提交Stanford HIV Drug Resistance Database (hivdb.stanford.edu),利用该网站提供的耐药序列分析软件HIVdb进行分析,寻找耐药相关突变。

2结果

2.1 plwj全长基因组克隆的构建及鉴定

应用长链PCR技术将plwj全长基因组分5’和3’前后半长进行扩增,扩增结果见图 2 ,5’前半长约为 5.2kb,3’后半长为 4.6kb。利用TA克隆技术将前后半长分别克隆入pCR-XL-TOPO载体上,共获得12株plwj-5’前半长克隆(命名为plwj-5’ half 1-12)和4株plwj-3’后半长克隆(命名为plwj-3’half 3-6)。通过对全长 plwj 基因组的酶切位点分析,在 vif 重叠区基因发现一个Aar I单一酶切位点,并利用载体上的单一酶切位点BamH I,将plwj-5’和plwj-3’前后半长分别双酶切后进行定向连接克隆,共获得12株plwj全基因组克隆,利用载体多克隆位点两端的BamH I和Not I单一酶切位点对全基因组克隆进行双酶切鉴定, 共切出两段,分别为近似HIV全长基因组片段(约9.8kb)及质粒载体片段(约3.5kb)。酶切片段大小均符合预期推断,提示全基因组克隆构建成功。

1 H2O; 2 lwj-5’half; 3 lwj-3’half; 4 DNA Marker DL15000

图2lwj-5’half and 3’half 前后半长PCR扩增图

2.2 衍生病毒的产生及其感染活性的鉴定

将12株plwj全基因组克隆分别转染293T细胞,48~72小时后检测转染上清中p24抗原来确定其有无衍生病毒产生。转染性实验结果提示12株plwj全基因组克隆中有9株转染上清p24抗原呈强阳性(OD>3.0),说明这些克隆株能在293T细胞内进行有效地病毒复制,并产生衍生病毒。转染上清经0.45μm过滤后感染经PHA-P刺激活化的PBMCs细胞,通过观察细胞病变产生情况并检测感染上清中的p24抗原来鉴定其感染活性。感染性实验结果显示有2株全基因组克隆plwj10+6和plwj13+6的感染上清p24抗原呈强阳性(OD>3.0),有4株呈弱阳性(OD约0.8),其余的很低或呈阴性。此外,其中有两株全基因组克隆(plwj2+6和plwj5+6)各自转染上清感染PBMCs细胞时感染性很低或呈弱阳性,但当这两株克隆质粒共转染293T细胞所产生的混合衍生病毒感染PBMCs细胞时则表现出强阳性,结果见表1。

表1plwj全基因组克隆转染和感染上清中P24抗原值

plasmid antigen p24 values of transfection supernatant antigen p24 values of infection supernatant

plwj1+4a >3.0 0.320

plwj2+6 >3.0 0.708

plwj3+6 >3.0 0.763

plwj4+6 >3.0 0.472

plwj5+6 >3.0 0.327

plwj6+6 >3.0 0.846

plwj7+6 0.076 0.066

Plwj8+6 0.073 0.087

plwj9+6 0.078 0.072

plwj10+6 >3.0 >3.0

plwj11+6 >3.0 >3.0

plwj12+6 >3.0 0.951

plwj5+6/plwj2+6b >3.0 >3.0

PNL4-3 >3.0 >3.0

Negative control 0.068 0.070

Uninfected cell culture supernatant controls 0.073 0.081

a The numeral of plwj 1+4 represents that the full-length clone plwj was constructed by ligation with plwj-5’half clone1 and plwj-3’half clone4, and so on.

b Clones plwj5+6 and plwj2+6 produced infectious virus upon cotransfection.

2.3 感染性克隆plwj全基因组序列分析

利用HIV databases 库中Sequence locator 工具对全基因组序列进行定位,结果显示plwj全长基因组共9719个碱基,包含了HIV-1所有的结构基因和调控序列。基因重组分析显示该毒株与consensus-B同源性最高,属于HIV-1 B亚型,且没有明显的与其它任何亚型序列发生遗传重组的迹象(图3)。将该序列与国际上HIV-1 M组各亚型参考株的全长序列进行系统进化树分析(图4),进一步证实plwj属于HIV-1 B亚型的衍生株Thai-B亚型,而且与河南有偿献血人群中Thai-B亚型流行株02HNsc11、02HNsq4、02HNsmx2及CNHN24最为接近,相对远离欧美B亚型毒株。序列耐药分析发现plwj没有导致现有抗病毒治疗药物(ARV)的耐药突变,这与样品采自中国开始大规模免费ARV治疗之前的时间相一致。

图3plwj全长基因序列的重组分析

图4plwj全长基因序列的系统进化树分析

病毒包膜的V3环是病毒感染细胞的主要决定簇,由特征性四肽组成。通过对V3环关键氨基酸的分析可预测HIV-1辅助受体的可能使用情况。如果这些关键的预测位点中精氨酸(R)被谷氨酰胺(Q)替换,HIV-1毒株则由使用CXCR4变为使用CCR5作为辅助受体进入细胞。我们分析了plwj全基因组克隆及其母本株lwj和河南Thai-B亚型代表株pCNHN24 的V3环主要氨基酸序列,结果显示三者V3环顶端四肽均为GPGR,而且其第11位均为带正电荷的精氨酸(R),见表2。因此,可预测plwj株与其它两株相似是利用CXCR4作为辅助受体。

表2plwj全基因组克隆V3环主要氨基酸序列

Amino acid sequence of V3 loop

plwj CTRPNNNTRKRVSIGPGRAWYTTKQIVGDIRQAHC

lwj CTRPNNNTRKRVSIGPGRAWYTTKQIVGDIRQAHC

pCNHN24 CTRPSNNTRKRVTLGPGRVWYTTGQIIGDIRRAHC

*图中红色标出V3 环第11位及顶端关键氨基酸序列

3讨论

长链扩增是困扰全长基因组克隆的难点之一。1994 年Barnes 和Cheng 等分别建立了长链PCR技术,使得几十个kb 的基因组片段得到有效扩增。考虑到PCR扩增的忠实性,我们采用Roche公司的Expand long template PCR system,该系统采用热稳定 Taq DNA 多聚酶和Tgo DNA 多聚酶混合物。该酶混合物不仅可以扩增长片段,而且具有很高的保真性。此外,为减少PCR 过程导致的点突变,混合3次PCR扩增产物,进行后续克隆。在克隆长片段时,我们曾尝试用普通的克隆试剂盒,结果不理想,直到后来改用Topo XL PCR Cloning Kit。该系统是用DNA 拓扑异构酶(Topoisomerase)将PCR产物连接到载体上,整个反应只需5min,而一般T4连接酶需过夜才能高效连接。此外,该克隆载体还引入ccdB (Control of cell death)基因,这样可以降低克隆背景,节省筛选的时间。特殊的凝胶纯化试剂(结晶紫纯化)使得可以直接在可见光下进行切胶纯化,这样可避免紫外线切割,从而提高长片段PCR克隆效率。

有文献报告在构建HIV 感染性分子克隆时最好选择低拷贝数的质粒载体[22],这是因为HIV 全长cDNA 两端具有同向的长末端重复序列,在复制过程中容易发生同源重组,并导致内含子的缺失,外源片段的插入,影响质粒的稳定性。此外,还应尽量采用缺失重组基因[ recA (-) ]的宿主菌[23]。但值得注意的是,最早的感染性克隆pNL4-3 即是用高拷贝的pUC18 质粒构建而成,至今仍然被广泛使用[24] 。本文所用的质粒构建载体是采用pCR-XL-TOPO也是用高拷贝的pUC载体系列,而在一年多时间应用过程中尚未发现上述不稳定因素,当然这还需要今后更长时间的实验验证其可行性。

HIV-1高度的遗传多样性,以及HIV-1复制过程中的高突变率、重组率和出错率造成体内大量HIV准种的存在,这样导致从前病毒基因组模板中扩增获得的序列必然呈现多样性。本实验构建的12株全基因组克隆中仅有2株呈现强感染性,其余为无感染性或感染性不强。这可能是HIV在体内复制过程中由于基因突变或缺失而导致其复制缺陷。值得关注的是,其中有两株全基因组克隆(plwj2+6和plwj5+6)各自转染上清感染PBMCs细胞时感染性很低或呈弱阳性,但当这两株克隆质粒共转染293T细胞所产生的混合衍生病毒感染PBMCs细胞时则表现出强阳性,这预示着这两株克隆由于基因变异使得在复制过程中产生缺陷病毒,但这两株缺陷病毒在功能上却能够进行互补,从而产生有感染性的衍生病毒。

plwj全基因组序列分析结果显示plwj克隆株为Thai-B亚型,该毒株虽然来自福建但它可能与河南有偿献血人群中流行的Thai-B亚型毒株02HNsc11、02HNsq4、02HNsmx2及CNHN24有共同的病毒起源,这与感染者自称其是经输血感染HIV事实相吻合。序列耐药分析发现plwj没有导致现有抗病毒治疗药物(ARV)的耐药突变,对ARV药物依然敏感。这与样品采自中国开始大规模免费ARV治疗之前的时间相一致。

该株感染性克隆的成功构建将为我省HIV-1病毒的生物学和免疫学特性研究提供有效的工具,为探讨我国主要HIV-1 流行毒株(Thai-B 、CRF07_BC、CRF08_BC)的致病机理奠定基础,同时也为抗HIV-1疫苗和药物的研究和评估及耐药性检测方面提供重要的工具。

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