RP-HPLC法同时测定加味黄龙颗粒中大黄酸\大黄素和大黄酚含量

【前言】RP-HPLC法同时测定加味黄龙颗粒中大黄酸\大黄素和大黄酚含量由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。【Key words】 Huanglong particle; Quality Control; HPLC 加味黄龙颗粒处方源于《伤寒六书》中，在黄龙汤的基础上加味组方的临床验方，具有泻热通便，益气养血的功效，主治阳明腑实兼气血不足之证，疗效确切，为了解决临床汤剂服用不便，服用量大，疗效等不稳定，笔...

【摘要】 目的 建立高效液相色谱法同时测定黄龙颗粒中3种成分的含量。方法 采用Hypersil ODSC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm),甲醇0.05％磷酸(85：15)为流动相，流速：0.8 ml/min，柱温：室温,检测波长：254 nm。结果 大黄酸、大黄素和大黄酚在5.55~90.28 μg/ml、5.24~87.54 μg/ml和6.33~95.78 μg/ml范围内呈良好的线性关系；相关系数分别0.9998、0.9999和0.9999；大黄酸、大黄素和大黄酚的平均加样回收率为98.17％(RSD=1.98％)、98.83％(RSD=2.05％)和96.81％(RSD=0.73％)。结论 该方法简便、可靠、准确，可用于黄龙颗粒的质量控制。

【关键词】 黄龙颗粒；质量控制；高效液相色谱法 Simultaneous determination of Rhein、Emodin and Chrysophanol in the Huanglong particle by HPLC

HUANG Qun,LIN Huanze,0QIU Zhenwen,et al.

People’s Hospital of Maoming City Guangdong 525000,China

【Abstract】 Objective To establish a HPLC method for the simultaneous determination of Rhein,Emodin and Chrysophanol in the Huanglong particle．Methods The determination was performed on Hypersil ODSC18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm)with mobile phase consisted of methanol0.05％phosphoric acid(85：15)at a flow rate of 0.8 ml/min.The UV detection wavelength was set at 254 nm．Results A good linearity was found over the concentration range of 5.55~90.28 μg/ml(Rhein)、5.24~87.54 μg/ml(Emodin)and 6.33~95.78 μg/ml(Chrysophanol)．The correlation coeficient was 0.9998(Rhein)、0.9999(Emodin)and 0.9999(Chrysophanol)respectively．The average recovery of particle was 98.17％(RSD=1.98％)、98.83％(RSD=2.05％)and 96.81％(RSD=0.73％).Conclusion The determination method is simple，reliable，accurate,and it can be used for quality control of Huanglong particle．

【Key words】

Huanglong particle; Quality Control; HPLC

加味黄龙颗粒处方源于《伤寒六书》中，在黄龙汤的基础上加味组方的临床验方，具有泻热通便，益气养血的功效，主治阳明腑实兼气血不足之证，疗效确切，为了解决临床汤剂服用不便，服用量大，疗效等不稳定，笔者根据传统验方制成黄龙颗粒，为了更好控制本品质量和各批次疗效的一致性，建立了RPHPLC法同时测定黄龙颗粒中大黄酸、大黄素和大黄酚含量［1，2］，方法简便，重现性好，回收率高，可用于实际质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器AngiLent1100 HPLC色谱仪；AngiLent1100系列四元梯度泵、AngiLent1100系列DAD、UV、FID等检测器、Chemstation数据处理软件系统，(美国AngiLent公司)。DL180型超声波清洗机(浙江象山县石浦海天电子仪器厂)；恒温干燥箱(北京市朝阳区来广营医疗器械厂)。DKS24型电热恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限公司)，DT100A型分析天平(北京光学仪器厂)。

1.2 试药 加味黄龙颗粒(自制，批号：081119、081127、081211)；大黄素对照品供含量测定用，(批号：200110,中国药品生物制品检定所)；大黄酚对照品供含量测定用，(批号：200716,中国药品生物制品检定所)；大黄酸对照品供含量测定用，(批号：200206,中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱：Hypersil ODSC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm),大连科学仪器有限公司生产，柱温：室温。检测波长：254 nm。流动相：甲醇0.05％磷酸(85：15)。流速：0.8 ml/min。进样量10 μl,理论板数(N)以芦荟大黄素对照品、大黄酸、大黄素、大黄酚计算分别为16221、14558、16557，三个活性成分与相邻峰之间分离度均大于1.5，对称因子在0.95~1.05之间。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷减压干燥的大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品适量，加甲醇分别制成含大黄酸、大黄素、大黄酚各约80 μg/ml的溶液；分别精密量取上述对照品溶液，混匀。即得，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取本品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 ml，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液用三氯甲烷提取4次，10 ml/次，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 测定法 分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.5 专属性试验 按处方比例制成缺大黄阴性对照，照供试品制备方法制备缺大黄阴性样品溶液，精密吸取溶液10 μl，照“2.1”项下色谱条件测定，结果阴性对照液在各个对照品和样品相同保留时间位置上均未见干扰。对照品溶液，缺大黄的阴性样品溶液，样品溶液HPLC图谱见图1。

a 对照品 b样品 c阴性对照品

图1 样品中大黄酸(1)、大黄素(2)和大黄酚(3)的色谱图2.6 线性范围的考察 精密量取大黄酸(0.1196 mg/ml)、大黄素(0.110

2 mg/ml)、大黄酚(0.1135 mg/ml)的混合对照品溶液0.5 ml、1 ml、2 ml、4 ml、8 ml,分别置10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇勺，0.45μm微孔滤膜滤过,按“2.1”项下的色谱条件测定，以进样浓度(μg/ml)为横坐标，对峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，其回归方程及线性范围如下，大黄酸：Y=16.11x+31.75，r=0.9998，5.55~90.28 μg/ml；大黄素：Y=19.17x22.65，r=0.9999，5.24~87.54 μg/ml；大黄酚：Y=24.55x23.38，r=0.9999，6.33~95.78 μg/ml。

2.7 精密度试验 取对照品溶液，精密吸取10 μl注入液相色谱仪，连续进样5次，测得大黄酸、大黄素和大黄酚峰面积的相对标准差(RSD)均

2.8 稳定性试验 取精密度实验的样品分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按 “2.1”项色谱条件测定其含量，测得样品中大黄酸、大黄素和大黄酚峰面积的相对标准差(RSD)均

2.9 重复性试验 按照正文拟定的含量测定方法，对同一批研究用样品，同时制备5份样品供试品溶液，按照上述“2.1”项色谱条件测定峰面积并计算大黄酸、大黄素和大黄酚的含量，其相对标准偏差

2.10 回收率试验 精密称取已知含量的样品(大黄酸2.5588 mg/g、大黄素2.0246 mg/g和大黄酚2.1159 mg/g)6份,约0.25 g,分别精密加入一定量的大黄酸、大黄素及大黄酚对照品，按照正文拟定的供试品制备方法制备加样回收供试品溶液，平行操作6份，按照上述“2.1”项色谱条件测定峰面积并计算其回收率，结果见表1。表1

加样回收率试验结果(n=6)

成分序号样品量(μg)加入量(μg)测得值(μg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)

大黄酸10.128240.102660.23224101.31 98.17±1.941.98

20.128660.102560.2270895.96

30.128540.128120.2526896.89

40.128180.128320.2535497.69

50.127780.153160.2772897.61

60.127560.153760.2806899.58

大黄素10.100220.080300.1795298.75 98.83±2.022.05

20.100360.081760.18316101.27

30.102520.102980.2022896.87

40.102980.102060.2028897.88

50.101160.121980.22470101.28

60.104780.122360.2233496.89

大黄酚10.106420.085760.1892496.57 96.81±0.710.73

20.106380.083900.1871096.21

30.106940.106440.2112097.95

40.106020.106220.2095097.42

50.105960.127820.2291296.35

60.106160.125720.2273096.362.11 样品的测定 取3批颗粒按上述方法进行分析测定计算，3批次样品大黄酸、大黄素及大黄酚平均含量分别为2.5622 mg/g、2.0209 mg/g、2.1238 mg/g,RSD分别为为0.12％、0.06％、0.20％。结果见表2。

表2

样品测定结果(mg/g,n＝3)

批号大黄酸大黄素大黄酚

0811192.56552.02122.1233

0811272.55982.02182.1284

0812112.56122.01962.1198

平均值2.56222.02092.1238

RSD（%）0.120.060.20

3 讨论

3.1 流动相及指标成分的选择 在本实验条件下，大黄酸的保留时间为6.5 min左右，大黄素的保留时间为8.5 min左右，大黄酚的保留时间为12 min左右分离效果好，达到基线分离，且在20 min内即可分离完毕。黄龙颗粒由大黄、芒硝、甘草、当归等中药组成，大黄为君药，故选择其中的3种蒽醌类成分作为含量测定的指标成分。甲醇0.1％磷酸溶液，甲醇0.05％磷酸溶液，甲醇水的洗脱系统进行考察。以甲醇水为流动相基础系统，进行了pH及极性调整，由于甲醇0.1％磷酸溶液系统酸性较强，易对色谱柱产生损害，故以甲醇0.05％磷酸溶液为流动相，且各峰对称性良好。大黄成分的含量测定方法文献报道较多，色谱条件及制备方法也有多

种多样，但是多采用单一成分为含量测定，该颗粒在提取工艺及制备工艺中，蒽醌类成分转移率差别较大，为了更好控制本品质量，笔者在本项目的研究工作中，参照中国药典2005年版一部大黄项下制备方法［1］，并采用其测定波长254 nm同时对3种蒽醌类成分进行定量测定，方法可行，分离度高。

3.2 三氯甲烷提取次数的选择［3，4］ 为确定提取次数，作者比较了样品经酸水解后用三氯甲烷提取3、4、5次后，测定含量，结果提取4次后大黄素及大黄酚提取量变化不大，因此选择提取4次。

3.3 本实验在测定了多批黄龙颗粒的基础上，依据新药开发指导原则，含量限度一般控制在30％以内的损失，建议其限度为“本品含大黄酸、大黄素和大黄酚的总量计，不得少于4.69 mg/g”。

参 考 文 献

［1］ 中国药典委员会.中国药典2005年版一部，2005：1718.

［2］ 张若燕，杨锡．HPLC测定小儿太极丸中大黄素及大黄酚的含量.中成药，2006，28(3)：442443.

［3］ 马广慈.药物分析方法与应用.科学出版社，2000.

［4］ 韩刚，安静，孙海燕，等．通脉降脂胶囊质量标准的建立.中成药，2005，27(7)：778780.