活血通痹片水提醇沉工艺研究

摘要　目的：筛选并优化活血通痹片提取醇沉工艺。方法：以干膏得率和提取物中芍药苷含量为考察指标，采用正交设计多指标综合评分法优化提取工艺。单因素考察不同醇沉浓度对芍药苷保留率的影响。结果：通过正交试验优化确定的提取条件为：药材饮片第一次以10倍水，第二次8倍，提取2次，每次90min。醇沉浓度为70％。结论：该制备工艺合理，有效成分保留率高。

关键词　芍药苷

活血通痹片是广东第二中医院院内制剂，由桃仁、红花、赤芍等十三味药组成，具有补肾、活血化瘀、除湿通络等功效，主治肾虚血瘀所致腰膝疼痛，腰肌劳损，肢节屈伸不利等病症。赤芍为毛茛科植物芍药Paceonia lacti flora Pall.的干燥根。赤芍作为本方臣药，具清热凉血，散瘀止痛之功效。因此，将赤芍中芍药苷含量作为指标性成分，结合提取工艺浸膏得率为考察指标，采用正交试验设计对其提取条件优选，采用单因素考察法对醇沉工艺进行优化，为生产工艺参数的确定提供依据。

1　仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪：G1316A检测器、G1312A二元泵、G1329A柱温箱、G2170A数据处理系统(Agilent，美国)；XS2055分析天平(梅特勒，瑞士)，药材饮片(广州致信药业有限公司，批号20100206)，芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110736-200901)，水为超纯水，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2，1　干膏得率的测定方法　取各正交实验号浓缩液10ml于干燥蒸发皿中水浴蒸干，照干燥失重测定法(中国药典2010年版一部附录IXG)测定，计算干膏得率。

2，2　芍药苷含量测定

2，2，1　对照品制备：利用分析天平精密称取已干燥的芍药苷对照品5.12mg，置于50ml容量瓶，甲醇溶解定容至50ml，即芍药苷为0.1024mg／ml。

2，2，2　样品制备及测定：取各正交实验号浓缩液5ml，置干燥蒸发皿中80℃水浴蒸干，甲醇溶解定容至50ml。同法制备阴性样品。

2，2，3　色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，5μm)；流动相：甲醇：0.1％磷酸水(14：86)；检测波长230nm，柱温25℃。将芍药苷对照品分别进样，2、3、4、6、8、10μl，由图1芍药苷在该色谱条件下峰形良好，其中芍药苷在204.8～1024ng范围内线性关系良好，回归方程为：峰面积Y=1.57942389X-2.6122678，r=0.99995(见图2)将阴性样品和待测样品进样检测，结果表明，阴性样品色谱在芍药苷相应的保留时间上无色谱峰(见图3)，样品中芍药苷色谱峰分离度良好(图4)。

2，2　吸水率考察　按处方称取的药材，加10倍量的水浸泡，每隔1个小时观察一次浸透心情况，直至药材全部浸透，滤过，量取滤液体积，计算药材吸水率，求得药材吸水率为192.3％。

2，3　正交设计优选提工艺　活血通痹片采用水煎煮提取工艺，在单因素试验考察的基础上，采用正交试验优化提取工艺，选取加水量(A)，提取次数(B)，提取时间(c)，作为考察因素，各取三水平，进行L9(34)正交试验，筛选最佳工艺条件，因素水平表见表1。赤芍作为方中臣药，芍药苷为其主要成分，本试验以高效液相法测定提取液中芍药苷的含量，作为评价指标之一，权重系数定为0.6；而作为有效成分煎出间接控制的一个指标，药效物质提取的多少以干膏得率为考察指标，权重系数定为0.4，以两指标的结果进行综合评分。

试验时按处方量称取药材、饮片，按正交试验设计各实验号进行提取，滤过，滤液减压浓缩，定容至200ml，备用。分别按2.2项下方法测定干膏得率、芍药苷含量，采用以下公式：

Y=(40／得膏率max)×得膏率+(60／(芍药苷含量)max)×(芍药苷)含量

进行综合评分，用SPSS11.0统计软件进行数据处理，对评分结果作直观分析和方差分析，以判断各因素对提取效果的影响程度，筛选出在该试验条件下最优的提取条件，试验安排及结果见表2，方差分析结果见表3。

由直观分析可知，影响提取工艺效果的因素顺序为：提取时间(B)>提取次数(c)>加水量(A)，最佳工艺组合为A283C2。方差分析结果显示，提取次数和提取时间均对提取结果具有显著性影响，而加水量对试验结果的影响无显著性影响。由于处方药材吸水率为192.3％，综合考虑缩短生产周期，降低生产成本等综合因素，选择第一次加水10倍量，第二次加水8倍，提取2次，每次提取90min作为水提取工艺参数。

2，4　验证实验　为确定该工艺条件的稳定性，以筛选的最佳条件，验证3批，结果见表4。验证试验结果与正交试验优选结果吻合，表明正交试验优选确定的工艺条件合理、稳定、可行。

2，5　醇沉工艺优选　中药提取液一般体积较大，一般需进一步分离和精制。药材的水提取药液常用醇沉方法，以除去杂质，从而达到减少服用量，提高药物稳定性的目的。考虑本活血通痹复方制剂最后制备成片剂，载药量小，所以对所得中药提取液进行醇沉精制，除去蛋白质、鞣质等杂质，进一步增大载药量。由于不同醇沉浓度除杂效果和有效成分保留率不一，故采用单因素考察法，以芍药苷保留率为指标，考察不同醇沉浓度对醇沉效果的影响。芍药苷保留率计算方法如下：

芍药苷保留率(％)=醇沉前芍药苷含量／醇沉后上清液芍药苷含量×100％

按处方比例称取药材4份，根据提取工艺试验结果，第一次加水10倍，第二次加水8倍，提取2次，各1.5h。提取完成后浓缩定容至200ml(相对密度1.08～1.10)，分别按下表加入乙醇至相应醇沉浓度，醇沉静置过夜24h，取上清液，回收乙醇，浓缩定容至200ml，按2.2项下测定芍药苷含量。

由表5可知，当随着醇沉乙醇浓度的加大，芍药苷保留率不断提高，醇沉浓度为70％时，芍药苷保留率可达95％以上，因此，确定活血通痹片的醇沉工艺为浓缩至相对密度1.08～1.10后，加乙醇至70％醇沉，静置过夜，取上清液，回收乙醇，浓缩，即得。

3　讨论

中药复方提取效果直接关系到产品的质量和疗效，选择评价提取工艺优劣的评价指标是研究工作中的重要问题，合理的提取工艺评价指标应该是提取的有效成分质和量的代表，也是提取物临床作用性质和强度的代表。本文选取了方中臣药芍药中主要成分芍药苷的含量以及得膏率二者综合评分作为考察指标，确定提取工艺为第一次加水10倍，第二次加水8倍，提取2次，各1.5h。确定醇沉工艺为提取完成后，浓缩至含生药1g／ml(相对密度1.08～1.10)，加乙醇至含醇量为70％，芍药苷保留率可达95％以上。

活血通痹片是在依据传统中医理论，结合目前药理研究的基础上化裁而来。为了使其复合功效得到良好发挥，根据处方所含有效成分，在制定制备工艺路线时采取分步考察，以期达到对本方中脂溶性和水溶性有效成分最大限度的提取目的。本实验对水提醇沉工艺进行了初步探讨，其他部分有待于进一步完善报道。