结核杆菌Ag85B基因疫苗的免疫保护效果研究

摘　要：为研究结核杆菌AJ95B基因疫苗的免疫原性和免疫保护效果，将雌性C57BL／6N小鼠32只，随机分为4组，即结核杆菌ag85b基因疫苗组、BCC组、pcDNA3．1(+)组和PBS组。取各免疫组小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平；同时进行CTL杀伤活性检测；进一步用结核杆菌H37Rv国际标准强毒株静脉注射攻击小鼠，计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数，对小鼠部分肺和脾组织作病理切片，HE染色观察组织病变程度，Z－N染色检查抗酸杆菌，观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果表明，结核杆菌Ag85B基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果，能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答，细胞因子IFN-y和IL-1分泌增加，IL-4分泌减少，CTL特异性活性增加；使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少，组织病变明显减轻。

关键词：结核杆菌；Ag85B；基因疫苗；免疫应答；免疫保护

中图分类号：Q78；R378

文献标识码：A

文章编号：1007-7847(2006)02―0128-06

近年来，随着人口流动的增加、结核杆菌多重耐药性菌株的出现以及结核病与艾滋病的伴发感染，结核病的疫情再度增高，给全球结核病的防治提出了新的挑战。降低结核病的患病率和死亡率，有效控制结核病，关键在于对结核病的有效预防。自1921年以来，卡介苗(BCG)就广泛应用于结核病的预防，大量的研究表明BCG对儿童原发性结核病具有较好的预防效果，但对结核病主要流行和传播形式的成人结核病，BCG的预防效果较差，因而研制和开发新型高效结核病疫苗对于结核病的有效控制具有十分重要的现实意义。本室构建了含结核杆菌Ag85B基因的真核表达质粒pcDNA3．1(+)-Ag85B能在体外成功表达相应抗原。在此基础上，进一步研究了其在小鼠体内诱导免疫应答的能力和对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果，旨在为研制新型结核病基因疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 质粒、菌株和细胞

质粒pcDNA3．1(+)和宿主菌JM109均由本室常规保存；质粒pcDNA3．1(+)-Ag85B(含人结核分枝杆菌H37Rv株的Ag85B基因)由本室构建；结核杆菌H37Rv国际标准强毒株有中国药品生物制品检定所提供；EL4／Ag85B细胞(H-2d)为转染pcDNA3．1(+)－Ag85B，并稳定表达Ag85B的EL4细胞。

1．1．2 主要试剂

去内毒素的质粒提取试剂盒(EndoFreePlas－mid Giga Kit)购自QIAGEN公司，TritonX-100、AMV一步法RT-PCR扩增试剂盒购自上海生工生物工程公司，Tripure试剂(Tripure lsolationReagent)购自Roche公司，乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit)购自日本MBL公司，小鼠细胞因子IFN-y、Ⅱ-2、IL-4 ELISA检测试剂盒购自深圳晶美公司，BCG、结核菌素纯化蛋白衍生物PPD购自成都生物制品研究所。

1．1．3 实验动物

雌性C57BL／6小鼠，7～8周龄，体重：18―20g，构自中国医学科学院实验动物研究所。

1．2 方法

1．2．1 结核杆菌Ag85B基因疫苗的制备

按去内毒素的质粒提取试剂盒(EndoFreePlasmidGigaKit，QIAGEN公司)说明书提取和纯化去内毒素的pcDNA3．1(+)-Ag85B质粒，分光光度计检测A260进行核酸定量计算，A260260／A280比值检测核酸纯度$，用无菌PBS稀释成1000mg／L。

1．2．2 结核杆菌Ag85B基因疫苗免疫小鼠

32只C57BL／6健康小鼠，随机分为4组，即结核杆菌Ag85B基因疫苗组、BCG组、pcDNA3．1(+)组和PBS组，每组8只小鼠。在小鼠双侧股四头肌多点注射0．25％Bupivacaine 100μL小鼠肌肉变性第5d，于相应部位多点注射结核杆菌Ag85B基因疫苗100μg，以pcDNA3．1(+)质粒为阴性对照，PBS作为空白对照，每隔3周免疫1次，共3次。卡介苗组尾部皮下注射1μ106CFU卡介苗(BCG)1次，作为阳性对照。

1．2．3 免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子的测定

第3次免疫后4周，每组处死3只小鼠，无菌条件下取出脾脏，分离脾细胞，细胞浓度5×106／mL，每种3个复孔，每孔中加入PPD(终浓度为1mg／L)，5％CO2孵箱中培养48h(IL-2测定)或72h(1L-4、IFN-y测定)后，收集脾细胞培养上清，用相应的ELISA检测试剂盒检测细胞因子水平。

1．2．4 乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定免疫小鼠特异性细胞毒性T细胞(CTL)活性

取新鲜制备的免疫小鼠脾细胞4×107接种于细胞培养瓶中，同时按1：4加入经丝裂霉素C去增殖的EL4／Ag85B靶细胞，培养1周作为效应细胞．以转染了质粒pcDNA3．1(+)-Ag85B的EL4细胞作为靶细胞。将效应细胞加在96孔培养板中，设100×104、50×104、10×104／(每孔100μL)3个浓度，每种3个复孔。加1×104／100μL孔的靶细胞悬液到效应细胞中，使效靶比例分别为100：1、50：1、10：1三个浓度，吹打混匀。按说明书分别设立靶细胞自发性释放组(100μL孔靶细胞+100μL孔培养液)，靶细胞最大释放组(100μL孔靶细胞+100μL孔1％TritonX-100溶液，置37℃，90％湿度，5％CO2孵箱中孵育8h．250g离心10min。每孔取100μL细胞培养上清，加入96孔细胞培养板中，于每孔中加入100 μL含酶底物，室温避光孵育30min．将细胞板于酶标仪中测490nm处吸光度。详见LDH-Cytotoxicity Assay Kit使用说明书。

1．2．5 结核杆菌H37Rv国际标准强毒株攻击C57BL／6免疫小鼠

每组另外5只免疫小鼠经尾静脉注射结核杆菌H37Rv国际标准强毒株1×106菌落形成单位(CFU)，攻击4周后，处死小鼠。无菌操作，取左肺和脾，称重。并精确称取部分含菌组织重量，生理盐水冲洗6次，按1：1(W：V)的比例加入生理盐水，用玻璃匀浆器匀浆，加入等体积4％硫酸处理20min以杀灭其他细菌，少量匀浆液涂片；

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将匀浆液按一定比例稀释后，接种改良罗氏培养基(1-J培养基)，37℃孵箱中培养4―8周后，进行结核杆菌菌落计数。右肺和脾组织的剩余部分进行固定、石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，镜检观察组织病理改变，同时进行抗酸染色。

1．2．6 统计学分析

利用SPSSl0．0统计分析软件，采用‘检验进行组与组之间的分析

2 结果

2．1 免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子(IFN-y、Il-2、IL-4)的测定(表1)

2．2免疫小鼠脾细胞Ag85B基因特异性CTL活性的测定

按公式计算细胞毒性百分率，细胞毒性百分率(％)＝[实验组A值-靶细胞自发性释放组A值]／(靶细胞最大释放组A值-靶细胞自发性释放组A值)]×100％．结果显示，效靶比为100：l、50：1、10：1时，结核杆菌Ag85B基因疫苗组的细胞毒。性百分率分别为55．3％、35．7％、9．2％，BCG组的细胞毒性百分率分别为28．9％、21．4％、9．8％，结核杆菌Ag85B基因疫苗组的细胞毒性百分率高于BCG免疫组、pcDNA3．1(+)阴性对照组和PBS空白对照组(p

2．3 C57BL／6小鼠肺和脾组织涂片结果

尾静脉注射结核杆菌H37Rv国际标准强毒株4周后，处死动物，肺和脾组织匀浆涂片，Z-N染色查抗酸杆菌，结果(表2)

２.4

C57BL小鼠肺和脾组织培养菌落计数

尾静脉注静射结核杆菌H37Rv国际标准强毒株4周后，外死动物，取左肺和部分脾组织匀浆，根据涂片结果按一定比例稀释，接种L-J培养基，37孵育4周，进行结核杆菌菌落计数(表3)

2．5 小鼠肺和脾组织病理切片观察组织病理改变

尾静脉注射结核杆菌H37Rv国际标准强毒株4周后，处死动物，取右肺和部分脾组织进行固定、石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，镜检观察组织病理改变。

2．5．1 肺组织病理改变

结核杆菌Ag85B基因疫苗组肺结构部分区域破坏，肺组织内散在结核病灶，少许干酪样坏死，液体渗出和淋巴细胞渗出较明显，结核结节较多，类上皮细胞和Langhan细胞较多，少许纤维化。结果(图2)。BCG组肺结构有少许破坏，结核结节，周围有较多淋巴细胞渗出，肺泡内渗出较多，干酪样坏死少，可见类上皮细胞和Lanshan细胞，结果(图3)。pcDNA3．1(+)组和PBS组肺结构有较多区域破坏，有多个散在结核病灶，干酪样坏死较多，液体渗出和淋巴细胞渗出明显，大量结核结节形成，纤维化罕见，结果(图4)。

2．5．2 脾组织病理改变

结核杆菌Ag85B基因疫苗组结核结节形成明显，少许干酪样坏死，类上皮细胞和Langhan细胞较多，少许纤维化；BCG组脾结构有少许破坏，可见结核结节形成，有少许干酪样坏死，类上皮细胞和Langhan细胞浸润；pcDNA3．1(+)组和PBS组结构破坏较明显，可见残缺红髓、白髓，组织内散在多个结核病灶，可见干酪样坏死，大量类上皮细胞和Langhan细胞聚集形成散在小结，纤维化罕见。

2．6 小鼠肺和脾组织病理切片进行结核杆菌计数

将小鼠肺、脾组织切片进行抗酸染色，检测组织内结核杆菌负荷，油镜下随机选10个视野，进行结核杆菌计数(表4)。

3 讨论

基因疫苗是疫苗研制的第3次革命，也为结核病疫苗的研制提供了新的思路。与传统疫苗相比，基因疫苗具有制备简便，性质稳定，免疫效果持久，可同时诱导体液免疫和细胞免疫应答等优点。本研究选择结核杆菌Ag85B基因作为结核病疫苗的目的抗原。Ag85B是新近发现的结核杆菌主要的分泌抗原，具有强大的免疫保护作用，能诱导强烈的体液免疫应答和特异性Thl型细胞免疫应答，分泌高水平的IFN-γ，产生对感染细胞有强溶解能力的细胞毒性T细胞(CTL)，减少免疫鼠脾脏和肺中的细菌数，保护小鼠抵御毒性结核杆菌的攻击。与BCG免疫保护水平相当，显示该抗原有很大的开发潜力，可望成为结核病基因疫苗的候选抗原或作为亚单位疫苗的组分，用于结核病的预防。

本实验主要研究结核杆菌Ag85B基因疫苗诱导小鼠产生的免疫效应和对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果表明，结核杆菌Ag85B基因疫苗免疫小鼠后，可诱导出较强的特异性CTL反应，超过BCG组，也能够诱导产生高水平的Thl型细胞因子IFN-γ、Il-2；而BCG在诱导产生高水平的IFN-T、11-2的同时，还能诱导Th2型细胞因子IL-4的产生。结核杆菌Ag85B基因疫苗和BCG均能明显降低肺和脾组织内结核杆菌载菌量，保护免疫小鼠抵御结核杆菌H37Rv国际标准强毒株攻击，结核杆菌Ag85B基因疫苗较BCG作用为弱。研究结果表明，结核杆菌Ag85B基因疫苗免疫小鼠后，在体内引起的特异性免疫应答以Thl型为主，但免疫原性不及BCG，诱导IFN-γ、Il-2的能力低于BCG，BCG则主要诱导混合型Th免疫应答。与国外其他有关结核杆菌基因疫苗的研究结果相似，结核杆菌Ag85B基因疫苗对结核杆菌感染具有一定的免疫保护效果，但保护作用不及BCG，因此，需采取构建多价基因疫苗等措施提高结核杆菌Ag85B基因疫苗的有效性，增加其对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。

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