念珠藻生长特性研究

摘 要：研究了念珠藻的生长周期、固氮特性、生长条件等生长特性。得出本实验念珠藻可以固氮；磷能有效制约其生长；需要长时间的光照等结果。

关键词：念珠藻；生长特性；异形胞

中图分类号：Q949．2

文献标识码：A

文章编号：1007-7847(2006)01-0055-06

念珠藻是淡水中常见的一类丝状固氮蓝藻， 它广泛分布于全球7大洲，从陆地到淡水生态 系统，从热带土壤到极地冰原，即使在极度干旱和 高紫外线照射的地区，念珠藻的一些种类，如 Nostoc flagelliforme(发状念珠藻，俗称发菜)也有 分布。念珠藻隶属于蓝藻门蓝藻纲段殖体目念 珠藻科。念珠藻的一些种在民间被作为野生蔬 菜食用。已有数千年的历史。念珠藻含有丰富 的营养价值，据分析，念珠藻体内含有丰富的果 胶、叶绿素a、叶黄素、胡萝卜素及藻胆素和藻蓝 蛋白(phycoyamin)。其中普通念珠藻(Nostoc commune)氨基酸的组成不亚于动物蛋白，铁的含 量每100g高达5746．39mg，对贫血患者是很好 的补铁食物，钙含量占干重的2，91％，是一种具 有潜在开发价值的补钙食品源之一。念珠藻类还 具有很大的医疗和保健作用，在《本草纲目》《本草 纲目拾遗》中有关于普通念珠藻的药用价值的记 载。近些年人们从念珠藻的甲醇提取物中，分 离到了一种有抗真菌活性的氨基酸衍生物一环肽 Nostofungicidine，发现其结构中包含新奇的β氨 基酸残基和3―氨基-6-羟基-硬脂酸残基。在 微藻产业方兴未艾的今天，念珠藻的营养价值及 其应用潜力再度引起研究者们的浓厚兴趣，念珠 藻的食用、药用及工业价值显示出良好的产业前 景。然而随着工业化进程的进一步深化，水体富营 养化程度也随之增加，目前已有一些关于饮用水 中蓝藻产生危害人类身体健康的报道，念珠藻也 位列其中。但是目前很少见到关于念珠藻生长特 性的报道，缺少对念珠藻进行深入研究的资料，鉴 于此，本实验室对从水源水中分离的念珠藻进行 了一系列生长特性的研究，以便于对其营养和安 全作进一步的研究和评价。

1 材料与方法

1．1 供试藻种

河北大学生命科学学院普通微生物学实验室 念珠藻(Nostoc，sp)的纯化藻种。

1．2 供试培养基

1)HGZ培养基：为本实验基础培养基．配置 方法如下(单位mg／L)：NAN03(1-500)，K2HP04 (39)，MgS04・H20(75)，NaC03(20)，CaCl2(27)， Na2Si03・9H20(58)，EDTA(1)，柠檬酸(6)，柠檬 酸铁(6)，A5(1)。

2)固体培养基：在基础培养基的基础上按 1．5％加入琼脂；

3)无氮培养基：在基础培养基的基础上去除 氮源NAN03；

4)无磷培养墓：在基础培养基的基础上去除 磷源K2HP03；

5)贫营养固体培养基：将2)的浓度降低一半，

1．3 培养条件

温度(28±1)℃，光照强度1 5001x左右，于 光照培养箱内24h持续光照培养，

1，4 实验方法

1．4．1 藻体生长状态观察

在无菌环境下300 mL的三角瓶中装入150 mLHGZ基础培养基，取新鲜绿色的藻悬液按l％ 量接种，置于光照培养箱培养，温度(281)℃， 光照强度15001x左右，24h持续光照。每隔3d 在显微镜下观察藻培养液一次，记录其生长特征。

1．4．2 生长曲线的绘制

在上述培养状态下每天将藻培养液在4 500 r／min下端,20rain，去上清，称取藻体湿重，以 生长时间为横坐标，藻体湿重为纵坐标，绘制生长 曲线。

1．4．3 考察念珠藻对氮磷的利用

通过在5)贫营养培养基中将念珠藻培养，以 造成念珠藻的饥饿生长状态，收获，制成藻悬液， 将藻悬液按1％量分别接种于基础培养基、无氮、 无磷3种培养基中，培养基装量为每50mL三角 瓶装液20mL。光照培养箱中培养，从三角瓶中 出现足够明显的藻团开始每隔一天观察并离心称 湿重，直至藻体出现大量明显的死亡，通过对比 观察，考察念珠藻对氮磷的吸收。

1．4．4 考察培养基不同状态对念珠藻生长的 影响

1，4．4，1 藻悬液的制备

取新鲜的念珠藻，离心，去上清，称重，加入适 量蒸馏水配成一定浓度的藻悬液。

1．4．4．2 接种

1)藻种接种于固体培养基上

超净工作台里在琼脂未凝固时用量筒准确量 取20mL培养基，倒平板，待平板凝固后用微量取 样器取0.2mL藻悬液接种于固体平板上，用三角 刮涂布，光照培养箱内培养。

2)藻种接种于液体培养基中

50mL三角瓶装液体培养基20mL，用微量 取样器取念珠藻悬液0．2mL接种，光照培养箱 内培养。

1．4．4，3 念珠藻的称取

1)液体培养念珠藻的称取

4500r／min离心15min，去上清，称取藻体 湿重。

2)固体培养念珠藻的称取

用接种环轻轻刮取固体培养基的藻体，再用 无菌水冲洗培养基表面，将藻体全部移入离心管 中，4500r／rain离心15 min，去上清，称取藻体 湿重。

1，4，4．4 比生长速率的计算

比增长率(μ)计算公式为：

μ=In(x2／X1)／t2-t1

式中，x1为某一时间间隔开始时的藻类湿重 (g)；x2为某一时间间隔终结时的藻体湿重(g)； t2-t1为某一时间间隔(d)。

1．4，5 考察不同光照时间对念珠藻的生长的 影响

用黑纸对三角瓶进行包裹达到无光效果，定 时进行包裹和拆开来控制光照时间。

控制每天受光时间分别为8、16、24h，28℃ 光照培养箱内培养14、14d内按时取样制片，显 微镜下观察并记录14d内藻的生长情况，考察光 照时间对藻生长的影响。

2 结果与讨论

2．1 藻体生长观察

以下是念珠藻生长状况的观察结果， 根据表I，以藻链的长度为指征，可以看出第 l～3d为藻生长的迟滞期，少量的断链、死链以 及厚壁孢子为种子所带进的，或在适应过程中所 产生的。当生长进入第3～9d的对数生长期后 断链、死链以及厚壁孢子迅速减少，以长链为主。 从第9d开始，长链减少，断链增加直至第12d 出现死亡，这一阶段为稳定期；之后进入死亡期， 断链、死链增加而长链减少。

由表I也可以发现异形胞与链的断裂有关， 可能会起一个断点的作用，即链由异形胞处断 裂，当链断裂后，异形胞自动脱落。

2．2 生长曲线的绘制

在生长进入的3d时出现肉眼可见的藻团， 即开始离心测定，至20d时藻体颜色完全变为黄 色，并藻体呈胶状，显微观察基本看不到生长良好 的细胞，遂停止测定。得出如下生长曲线：

念珠藻的生长曲线并不典型，从图5看出第 13d进入稳定期，第15d进入死亡期，与观察的 结果并不相符，可能是由于念珠藻在生长的后期 会产生大量的储藏物如多糖，从图5可以看出第 11-13 d湿重迅速增加，而这一时期正是显微镜 观察到的稳定期，大量藻体死亡的同时产生储藏 物。这一过程在离心称重时也有所反映，三角瓶 底部有大量透明胶状物附着。随着时间的推移营 养物耗尽藻细胞大量自溶，储藏物不再产生甚至 被消耗，湿重下降。

2．3 氮磷对念珠藻生长的影响

以下为念珠藻分别在基础培养基、无氮培养 基、无磷培养基中的生长曲线。

由图6可见：无氮源培养基中，念珠藻生长周 期较长，生长滞后于HGZ培养基，在第17d时， 藻体颜色仍为深绿色，而正常浓度的培养基中第 9d藻体颜色已呈黄色。无氮培养基中念珠藻异 形胞始终都很明显，正常浓度HGZ培养基中的念 珠进入稳定期的一小段时期内出现。因此推测， 念珠链中的异形胞和念珠藻的生物固氮特性关系 紧密。

磷对念珠藻的生长影响较大，在无磷培养基 中的念珠藻几乎没有长，但可以形成厚壁孢子，把 厚壁孢子转接入HGZ培养基后，仍可正常生长。

2．4 不同培养基状态对念珠藻生长的影响

在第5d固体平板出现一定量的藻群落开始 离心测定，到第10d固体平板局部发干，部分藻 体贴到壁上影响测定而停止离心测定。计算念珠 藻生长的比生长速率。以生长天数为横坐标， 比 生长速率为纵坐标绘制比生长曲线，两种生长状 态下的念珠藻比生长速率曲线如下图7(其中左 图为固体培养念珠藻，右图为液体培养念珠藻)：

从图7可看出，固体培养的念珠藻在前5d 要慢于液体培养，根据测定与观察发现，固体培养 念珠藻第7―9 d时进入旺盛生长，表现为，藻体 布满培养基表面，藻体表面由于生长旺盛出现大 量气泡。液体培养念珠藻在第6―7d生长达到顶 峰，藻体深绿液面有大量气泡，到第12d时已出 现大量发黄的藻体。显微观察有大量藻体死亡。通 过图7，可见固体培养的念珠藻仍有继续生长的趋 势，在第9d时固体培养的念珠藻生物量已高于 液体培养念珠藻的最大生物量．推测在前期，固 体培养基内从液体培养基转接来的念珠藻并不适 应固体培养，也不能像液体培养基中的念珠藻一 样充分获得氮元素，经过一段时间的适应后，藻体 一方面适应了固体环境，另一方面固氮机制启动， 藻体既从培养基中获取氮源，又通过自身固氮得 到了氮源，所以生长并不比液体培养状态的差，甚 至比液体培养的状态还要好。同时也说明，其他 营养因子对念珠藻的生长影响不大。

固体培养念珠藻在不同时期细胞大小也有所 不同，表2是选取的几个有代表意义的时期细胞 大小。

根据表2，液体培养念珠藻细胞变化不大，只 是在生长末期出现细胞拉长的现象，是细胞死亡 的表象。固体培养念珠藻变化较为丰富，在生长 期时细胞与液体培养基中细胞大小相似；在生长 旺盛时细胞变大，以充分吸收外部的营养，生长状 态极佳；而到了第18d时，培养基干涸，为了适应 缺水的环境，念珠藻不得不通过减小细胞表面积 来减少水分的散失，而此时观察到的念珠藻仍然 为绿色，有顺直的链，但链并不长。

可见，念珠藻适应能力很强，藻既适应固体培 养状态又适应液体培养状态，若要尽早收获藻体可 选用液体培养，若要大量收获则选用固体培养。

2．5 不同光照时间对念珠藻生长的影响结果

由表3、图9、10可见：光照对念珠藻的生长 影响很明显，每天光照8h的藻基本未见生长，每 天光照16h的藻链弯曲，生物量极少，每天光照 24h的藻生长良好，藻链长且顺直，异形胞少，一 链一个或没有，生物量大。可以认为在此条件下 24 h／d的光照时间最适宜念珠藻生长。此结果 不同于自然界中的情况，可能是该藻种经过长期 驯化的结果。

3 讨论

就本实验结果来看念珠藻在300mL三角瓶 150mL培养基装量培养状态下，念珠藻的迟滞期 为第1～3 d。第3―9d为对数生长期，从第9d 至第12d为稳定期，之后进入死亡期。

念珠藻有固氮特性，无氮培养停滞期较长，异 形胞可能对固氮特性有作用。

磷元素限制念珠藻生长，可通过控制水体中 磷的排放减少念珠藻的生长。

念珠藻既适应固体培养状态又适应液体培养 状态，若要尽早收获藻体可选用液体培养，若要大 量收获则选用固体培养。

光照是影响念珠生长的决定因素，长时间足 量光照有利于其生长。

另外，实验过程中也发现当念珠藻突然遇到 恶劣环境时(如培养温度大幅上升，饥饿等)异形 胞数量显著增加，可以认为异形胞是应对不良环 境所产生的。

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